Spectrométrie de masse des modifications induites ou post-traductionnelles de protéines PDF Download
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Author: Guillaume Gabant Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 0
Book Description
Les modifications de protéines, qu'elles soient post-traductionnelles (PTMs) ou induites chimiquement, ont une influence considérable sur l'activité des protéines. Des méthodes de spectrométrie de masse (MS) HRMS, MS/MS CID et ETD, et de biochimie ont été développées pour la caractérisation structurale et cinétique de complexes protéine-ligand et de PTMs, dans le but de disséquer leur mécanisme et de concevoir des médicaments covalents contre des protéines liant des protéases, des kinases, ou l'ADN. La MS combinée avec des outils biochimiques a permis de séquencer l'inhibiteur de protéases grégline, et de détecter une PTM originale. De même, la transposase MOS1, modèle de l'intégrase du VIH pour la conception d'inhibiteurs, s'avère être à la fois acétylée et phosphorylée. Pour la lyase Abf2, une stratégie de piégeage, purification, protéolyse et hydrolyse ADN du complexe covalent Abf2-ADN, couplée à l'analyse MS, a été développée. Enfin, l'interaction entre le surpresseur de métastase hPEBP1 et la locostatine a été disséquée sur la protéine entière et par approche bottom-up. La locostatine s'hydrolyse en butyrate après fixation. Afin d'identifier le site ciblé par la locostatine, les conditions de réaction et de protéolyse ont été optimisées. La présence de réactions non spécifiques a conduit au développement 1) d'un modèle mathématique permettant de déterminer la fraction de liaison optimale pour discriminer le site spécifique des sites non-spécifiques, et 2) d'une méthode pour la quantification parallèle et exhaustive du degré de modification de tous les sites modifiés d'une protéine. Ces outils sont applicables aux ligands covalents de protéines et/ou à leurs PTMs.
Author: Guillaume Gabant Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 0
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Les modifications de protéines, qu'elles soient post-traductionnelles (PTMs) ou induites chimiquement, ont une influence considérable sur l'activité des protéines. Des méthodes de spectrométrie de masse (MS) HRMS, MS/MS CID et ETD, et de biochimie ont été développées pour la caractérisation structurale et cinétique de complexes protéine-ligand et de PTMs, dans le but de disséquer leur mécanisme et de concevoir des médicaments covalents contre des protéines liant des protéases, des kinases, ou l'ADN. La MS combinée avec des outils biochimiques a permis de séquencer l'inhibiteur de protéases grégline, et de détecter une PTM originale. De même, la transposase MOS1, modèle de l'intégrase du VIH pour la conception d'inhibiteurs, s'avère être à la fois acétylée et phosphorylée. Pour la lyase Abf2, une stratégie de piégeage, purification, protéolyse et hydrolyse ADN du complexe covalent Abf2-ADN, couplée à l'analyse MS, a été développée. Enfin, l'interaction entre le surpresseur de métastase hPEBP1 et la locostatine a été disséquée sur la protéine entière et par approche bottom-up. La locostatine s'hydrolyse en butyrate après fixation. Afin d'identifier le site ciblé par la locostatine, les conditions de réaction et de protéolyse ont été optimisées. La présence de réactions non spécifiques a conduit au développement 1) d'un modèle mathématique permettant de déterminer la fraction de liaison optimale pour discriminer le site spécifique des sites non-spécifiques, et 2) d'une méthode pour la quantification parallèle et exhaustive du degré de modification de tous les sites modifiés d'une protéine. Ces outils sont applicables aux ligands covalents de protéines et/ou à leurs PTMs.
Author: John R. Griffiths Publisher: John Wiley & Sons ISBN: 1119045851 Category : Science Languages : en Pages : 414
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Covers all major modifications, including phosphorylation, glycosylation, acetylation, ubiquitination, sulfonation and and glycation Discussion of the chemistry behind each modification, along with key methods and references Contributions from some of the leading researchers in the field A valuable reference source for all laboratories undertaking proteomics, mass spectrometry and post-translational modification research
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Ces 10 dernières années ont vu une évolution rapide de la spectrométrie de masse en fonction des besoins croissant des biologistes, dès l'avènement des nouvelles techniques d'ionisation dite douces que sont le MALDI (Désorption Ionisation laser assisté par matrice) et l'ESI (ionisation electrospray) permettant enfin la détection intacte de molécules d'origine biologique.Ce travail de thèse a porté principalement sur le choix et la mise au point de la stratégie instrumentale et analytique pour mener à bien quatre collaborations, soient quatre problèmes montrant à la fois la diversité des approches et la multiplicité des solutions apportées par la spectrométrie de masse. Le premier sujet a porté sur l'isolement de peptides biologiquement actifs dans l'hémolymphe de drosophiles immunisées. Nous avons réalisé le séquençage de novo par spectrométrie de masse de l'un de ces peptides bloqué en N-terminal, appelé DIM 13 (Drosophila Immune Induced molecule 13). Le second sujet a porté sur l'étude de la conformité structurale d'une enzyme, la dipeptidyl-diamino-peptidase. Nous avons pu établir la conformité de la protéine recombinante par rapport à la protéine naturelle et donné la description détaillée de ses modifications post-traductionnnelles.Le troisième sujet a consisté à l'établissement du protéome de la rétine de souris. Une première approche a conduit à l'identification d'une centaine de protéines de la rétine. Puis dans une seconde approche une étude différentielle a été entreprise comparant les protéines observées sur gel SDS PAGE 2D obtenu à partir de rétines de souris normales versus les protéines obtenues à partir de rétines de souris rd1 (retinal degenerescence 1). Enfin la dernière étude a porté sur la description de la composition en protéines d'un complexe de facteur de transcription, le complexe TFTC. Notre approche a permis d'ajouter 2 nouvelles protéines à la liste des protéine déjà identifiées par des méthodes de biochimie classique.
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE FAB OCCUPE A L'HEURE ACTUELLE UNE PLACE IMPORTANCE DANS L'ETUDE DES PROTEINES; ELLE TROUVE SA PLEINE UTILISATION DANS CERTAINES ANALYSES TRES DIFFICILES A REALISER PAR LES METHODES TRADITIONNELLES COMME LA LOCALISATION ET LA DETERMINATION DE MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES ET DE MUTATIONS EN PATHOLOGIE HUMAINE. DES ANALYSES UTILISANT CONJOINTEMENT DES METHODES DE SPECTROMETRIE DE MASSE: FAB-MAPPING ET SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM ET DES DEGRADATIONS ENZYMATIQUES NOUS ONT PERMIS DE CARACTERISER DE NOUVEAUX MUTANTS DE L'HEMOGLOBINE (MUTANT GRENOBLE ET MUTANT R). LA STRATEGIE UTILISEE A ETE PREALABLEMENT TESTEE SUR DES MUTANTS CONNUS. L'IDENTIFICATION DE DEUX RESIDUS ACETYLE SUR DES ENZYMES ERYTHROCYTAIRES MPGM ET DPGM A ETE REALISE SELON DES STRATEGIES VOISINES. AFIN D'ESSAYER DE RESOUDRE LES PROBLEMES POSES PAR LA DESORPTION DE PEPTIDES EN MELANGE DANS LE MODE D'IONISATION FAB, NOUS AVONS, EN REGARD AVEC DES DONNEES DE LA LITTERATURE, REALISE UNE SERIE DE DERIVATIONS TENDANT A AUGMENTER L'HYDROPHOBIE DES DIFFERENTS CONSTITUANTS ET ACCROITRE AINSI LE RENDEMENT D'IONISATION. CETTE TECHNIQUE DE DERIVATION A PERMIS LA VISUALISATION DE LA TOTALITE DES PEPTIDES ISSUS DE LA CHAINE AINSI QUE L'IDENTIFICATION DE MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES SUR LE PEPTIDE C TERMINAL DE LA TUBULINE QUI N'ETAIT PAS DESORBE A L'ETAT NATIF
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE EST AUJOURD'HUI DEVENUE UNE TECHNIQUE INCONTOURNABLE POUR LA RECHERCHE EN BIOCHIMIE. ELLE A CONNU CES DIX DERNIERES ANNEES, UN ESSOR CONSIDERABLE DANS LA CARACTERISATION DES BIOMOLECULES ET EN PARTICULIER DANS L'ANALYSE DES PEPTIDES ET DES PROTEINES. CE TRAVAIL DE THESE A ETE ORIENTE SIMULTANEMENT DANS DEUX DIRECTIONS. NOUS AVONS D'UNE PART PROGRESSE DANS L'UTILISATION DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR OBTENIR DES DONNEES STRUCTURALES, PRINCIPALEMENT EN FOCALISANT SUR L'AMELIORATION DE LA METHODE POUR ATTEINDRE LE DOMAINE SUB-PICOMOLAIRE. NOUS AVONS AMELIORE : - LA SENSIBILITE EN NANOES-MS A L'AIDE D'UN BANC D'ESSAI PERMETTANT L'EVALUATION DU CAPILLAIRE. - LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE EN MALDI-MS GRACE A UNE PREPARATION DE L'ECHANTILLON ADAPTEE. NOUS AVONS D'AUTRE PART, RELEVE LE DEFI QUI CONSISTAIT A RESOUDRE DES PROBLEMES DE CARACTERISATION POSES PAR LES BIOCHIMISTES AUX SPECTROMETRISTES DE MASSE, APRES EPUISEMENT DE TOUTES LES AUTRES POSSIBILITES DES ANALYSES CLASSIQUES (RMN, DEGRADATION D'EDMAN, COMPOSITION EN ACIDES AMINES, GEL D'ELECTROPHORESE). GRACE AU GAIN DE SENSIBILITE ET A L'AMELIORATION DE LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE, NOUS AVONS PU ABORDE L'ETUDE DE PROBLEMES BIOLOGIQUES REELS ET AINSI CARACTERISER : - LA PREMIERE TOXINE DE SCORPION GLYCOSYLEE, - UN PEPTIDE ANTIBACTERIEN DE CREVETTE PANAEUS VANNAMEI, - UNE NOUVELLE MODIFICATION POST-TRADUCTIONNELLE DE LA SCHISTOSOMA MANSONI P28. NOUS AVONS D'AUTRE PART : - IDENTIFIE LA KININOGENE HUMAINE, PROTEINE RESPONSABLE DE L'IMMUNOGENICITE DE LOTS DE FACTEUR VIII. CETTE ETUDE S'INSCRIT DANS LE CADRE GENERAL DU PROJET PROTEOME, - LOCALISE UN PEPTIDE MODIFIE CHIMIQUEMENT PAR PHOTOMARQUAGE LORS DE L'ETUDE DES SITES DE LIAISON DE LA BUCHE, - DETERMINE DES SITES SPECIFIQUES D'HYDROLYSE DE LA GPV ET DE RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (PAR 1, PAR 2).
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La spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight) et ESI-TOF (electrospray ionization- time of flight) permettent d'accéder à des méthodologies performantes pour l'étude de la structure primaire des protéines. Ce travail a mis en oeuvre ces deux modes d'ionisation pour étudier les modifications covalentes de trois protéines impliquées dans des contextes biologiques différents. En premier lieu, les modifications post-traductionnelles de deux nitrile hydratases (NHases), métalloenzymes bactériennes catalysant l'hydrolyse de nitriles en amides, ont été caractérisées. Des études sur les protéines intactes ont mis en évidence deux modifications post-traductionnelles--un acide sulfénique et un acide sulfinique--sur les cystéines du centre actif de deux NHases de bactéries différentes. Ensuite, nous avons caractérisé les modifications post-traductionnelles d'une protéine intervenant dans la coagulation sanguine, le facteur IX (FIX), dans le but d'établir une référence structurale du FIX plasmatique. Cette protéine comporte un ensemble de modifications complexes incluant en particulier N-glycosylations, O-glycosylations, phosphorylation et sulfatation, localisées sur une région de la protéine, le peptide d'activation. En dernier lieu, nous avons étudié les mécanismes d'inhibition suicide de deux cytochromes P450. Pour cela, nous avons caractérisé, grâce à des techniques de marquage par des isotopes stables, les métabolites produits lors de l'hydroxylation de l'acide tiénilique par le P450 2C9, réaction conduisant également à l'inactivation de l'enzyme. Ces expériences ont conduit à proposer deux mécanismes réactionnels différents pour ce composé. Le mécanisme de l'inhibition suicide d'un P450 d'origine végétale a été abordé en cherchant à identifier les peptides marqués pendant la réaction. Cette identification n'a pas été obtenue, vraisemblablement en raison de l'instabilité du marquage dans nos conditions d'analyse.
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DANS LE CADRE DES ETUDES PORTANT SUR LES RELATIONS STRUCTURES/FONCTIONS DES MOCROMOLECULES BIOLOGIQUES, NOUS AVONS DEVELOPPE ET ADAPTE LA SPECTROMETRIE DE MASSE AVEC IONISATION PAR ELECTROSPRAY (ESMS) A L'ETUDE STRUCTURALE DES PROTEINES. CETTE NOUVELLE METHODE UTILISEE EN COMPLEMENT D'AUTRES TECHNIQUES D'ANALYSE A PERMIS DE METTRE EN EVIDENCE DES CHANGEMENTS MEME MINEURS DE LA STRUCTURE DES PROTEINES. EN ADAPTANT LES CONDITIONS D'IONISATION, NOUS AVONS PU MONTRER LA PRESENCE DE MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES ACIDOLABILES (SULFATATION, PHOSPHORYLATION) OU CHIMIQUES (INTERMEDIAIRE CYCLIQUE DE D'AMIDATION). DE PLUS, LA CONNAISSANCE DE LA PHYSICO-CHIMIE DU SPRAY NOUS A PERMIS D'OUVRIR LA VOIE A L'ETUDE DE COMPLEXES DE TYPE NON-COVALENTS (ENZYME/SUBSTRATS, ENZYME/COFACTEUR) DIFFICILEMENT ETUDIABLES PAR LES METHODES CLASSIQUES DE BIOCHIMIE
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AU COURS DE CE TRAVAIL NOUS AVONS UTILISE DIFFERENTES TECHNIQUES DE SPECTROMETRIE DE MASSE DESTINEES A RESOUDRE DES PROBLEMES ANALYTIQUES DANS LE DOMAINE DE LA STRUCTURE DES PROTEINES. DANS LE BUT DE GAGNER DU TEMPS ET DE LA SENSIBILITE DANS LES ANALYSES, NOUS AVONS DEVELOPPE LE COUPLAGE DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE (HPLC) AVEC LA SPECTROMETRIE DE MASSE (MS) EN MODE FAB FAST ATOM BOMBARDMENT PAR L'INTERFACE FAB A FLUX CONTINU (CF/FAB). CE COUPLAGE A ETE REALISE AVEC DES COLONNES CAPILLAIRES DE DIAMETRE INTERNE 0,25 MM. IL S'EST AVERE ETRE BIEN ADAPTE A L'ETUDE DE MELANGES COMPLEXES DE PEPTIDES DE MASSES INFERIEURES A 5000 DA AVEC UNE SENSIBILITE DE L'ORDRE DE 20 A 200 PMOL POUR UN PEPTIDE DE MASSE 1000 DA. CETTE SENSIBILITE DECROIT AU FUR ET A MESURE QUE NOUS ELEVONS DANS LE DOMAINE DE MASSE. PAR LA SUITE, LES TECHNIQUES DE COUPLAGE DE L'HPLC AVEC LA SPECTROMETRIE DE MASSE, PAR L'INTERFACE CF/FAB MAIS AUSSI PAR L'INTERFACE ELECTROSPRAY (ESI), ONT ETE UTILISEES POUR L'ETUDE DE LA STRUCTURE PRIMAIRE ET DES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES DES PROTEINES H, T ET L DU COMPLEXE DE LA GLYCINE DECARBOXYLASE DES MITOCHONDRIES DES FEUILLES DE POIS. AINSI, LES ANALYSES DES FRAGMENTS ISSUS DE COUPURES CHIMIQUES OU ENZYMATIQUES DES PROTEINES H (14,1 KDA) ET T (40,9 KDA) ONT PERMIS DE VERIFIER LES SEQUENCES DE CES DEUX PROTEINES ETABLIES A PARTIR DE LEURS ADNC. NOUS AVONS AUSSI LOCALISER LA POSITION EXACTE DU COFACTEUR LIPOATE DE LA PROTEINE H. LA MESURE DE LA MASSE DE LA PROTEINE L (49,7 KDA) CONFIRME LA SEQUENCE DE LA PROTEINE. DE PLUS, ELLE MONTRE QU'IL N'Y A DE LIAISON COVALENTE NI ENTRE LES DEUX SOUS UNITES DE LA PROTEINE, NI ENTRE LA PROTEINE ET SON COFACTEUR, ET QUE LA PROTEINE L CONTIENT UNE MODIFICATION POST-TRADUCTIONNELLE DE 32 DA ENVIRON
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Au cours de la spermatogenèse, la chromatine passe d'un état diffus dans la cellule somatique à un état fortement condensé dans les spermatozoïdes murs. Ce remaniement s'accompagne d'un remplacement des histones somatiques par des protéines plus basiques appelées protamines, soit directement, soit après mise en place de protéines intermédiaires spécifiques des spermatides. La compréhension des différents mécanismes impliqués dans cette condensation chromatinienne passe par la détermination de la structure primaire de ces protéines, mais également par la localisation de leurs différentes modifications post-traductionnelles. La structure de ces protéines spécifiques de la spermatogenèse se caractérise par : des séquences répétitives de groupements arginyl, la présence de variants structuraux, la faible diversité en acides aminés et divers degrés de phosphorylation. L'apport de la spectrométrie de masse a été fondamental dans la résolution de ces problèmes structuraux. La spectrométrie de masse à bombardement par atomes rapides ou fab ainsi que la technique électrospray ou es-ms nous ont permis d'élucider la structure complète de la protamine z3 de roussette, de mettre en évidence deux variants structuraux de la protéine intermédiaire tp1 de bélier, d'obtenir des éléments de structure de la protéine tp2 de bélier, et enfin de localiser le site de phosphorylation de la protamine isolée du testicule de bélier. Ces techniques ont été également prépondérantes dans la détermination du groupement acétyl bloquant de l'histone h5 de xenopus laevis et dans le positionnement des résidus acétyles et méthyles de la partie nh#2-terminale de l'histone h4 de thymus de veau
Author: Guillaume Gabant
Author: Guillaume Gabant
Author: John R. Griffiths
Author: Nükhet Cavusoglu
Author: Françoise Pratbernou
Author: DAMARYS.. LOEW
Author: Rusconi, Filippo
Author: Maya Belghazi
Author: MICHEL.. JAQUINOD
Author: VERONIQUE.. LOUVET MERAND
Author: Mostafa Kouach