Immobilisation d'enzymes pour la réalisation de biocapteurs. Analyse par injection en flux continu (FIA). Applications au dosage des composés polluants PDF Download
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Book Description
Cette étude porte sur la réalisation de biocapteurs et la mise au point d'un système d'analyse par injection en flux continu (FIA). Ces systèmes sont destinés au dosage de composés polluants présents dans l'eau, notamment de pesticides organophosphores et de carbamates. Ces biocapteurs associent une électrode de pH et une membrane enzymatique. Différentes techniques d'immobilisation des cholinesterases (acétylcholinestérase et butyrylcholinestérase) sur des membranes polyamide pré-activées, par piégeage dans un gel polymère et sur des membranes en toile de nylonTM sont d'abord présentées. Ensuite, l'optimisation des conditions opératoires et la comparaison de leurs performances sont examinées. Des capteurs enzymatiques à réponse rapide, pour le dosage de substrat, sont réalisés grâce à une nouvelle technique d'immobilisation d'enzyme sur électrode de verre (brevet français F-9011630, 1990). La nouveauté de cette technique réside dans le dépôt d'un agent réticulant vaporisé sur l'extrémité sensible de l'électrode de verre. Une simulation mathématique de la réponse de ces biocapteurs permet d'apprécier les quantités d'enzyme immobilisées. Un système FIA basé sur l'inhibition de l'acetylcholinestérase immobilisée au sein d'un réacteur tubulaire à rangée de billes, est mis au point pour le dosage des organophosphates et des carbamates. Plusieurs paramètres opératoires sont d'abord optimisés. Ce système est ensuite appliqué au dosage d'insecticides contaminant accidentellement l'eau de mer. La réactivation de l'enzyme inhibée dans le réacteur, permet sa réutilisation de nombreuses fois.
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Cette étude porte sur la réalisation de biocapteurs et la mise au point d'un système d'analyse par injection en flux continu (FIA). Ces systèmes sont destinés au dosage de composés polluants présents dans l'eau, notamment de pesticides organophosphores et de carbamates. Ces biocapteurs associent une électrode de pH et une membrane enzymatique. Différentes techniques d'immobilisation des cholinesterases (acétylcholinestérase et butyrylcholinestérase) sur des membranes polyamide pré-activées, par piégeage dans un gel polymère et sur des membranes en toile de nylonTM sont d'abord présentées. Ensuite, l'optimisation des conditions opératoires et la comparaison de leurs performances sont examinées. Des capteurs enzymatiques à réponse rapide, pour le dosage de substrat, sont réalisés grâce à une nouvelle technique d'immobilisation d'enzyme sur électrode de verre (brevet français F-9011630, 1990). La nouveauté de cette technique réside dans le dépôt d'un agent réticulant vaporisé sur l'extrémité sensible de l'électrode de verre. Une simulation mathématique de la réponse de ces biocapteurs permet d'apprécier les quantités d'enzyme immobilisées. Un système FIA basé sur l'inhibition de l'acetylcholinestérase immobilisée au sein d'un réacteur tubulaire à rangée de billes, est mis au point pour le dosage des organophosphates et des carbamates. Plusieurs paramètres opératoires sont d'abord optimisés. Ce système est ensuite appliqué au dosage d'insecticides contaminant accidentellement l'eau de mer. La réactivation de l'enzyme inhibée dans le réacteur, permet sa réutilisation de nombreuses fois.
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Les biocapteurs ampérométriques décrits dans ce travail sont basés sur l'immobilisation d'enzymes oxydo-réductases dans un polymère conducteur déposé à la surface des électrodes. Les performances des biocapteurs sont conditionnées par la méthode d'immobilisation mise en œuvre ainsi que par les caractéristiques de la matrice qui en résulte. Une technique de polymérisation électrochimique a été utilisée pour fixer l'enzyme dans un dérivé du polythiophène, le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) (PEDT). Les potentialités de cette technique ont été démontrées pour deux enzymes différentes : la glucose oxydase et la polyphénol oxydase. L'optimisation des paramètres opérationnels a été conduite d'abord en système batch, puis étendue au système d'analyse en flux continu (FIA). Ce système biocapteur-FIA est très adapté pour des mesures en continu du glucose dans les échantillons biologiques. La sélectivité de ce biocapteur en présence de composés interférents a été améliorée par la platinisation de l'électrode, qui rehausse la réponse au glucose, ou l'utilisation des médiateurs rédox. Un biocapteur à polyphénol oxydase exploitant l'amplification enzymatique mise en jeu a permis la détection des polluants phénoliques jusqu'à 50 nM.
Author: Helmut Meier Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 174
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This work concerns the development of an enzyme electrode which can be used for continuous on-line measurement in a fermentation process. Firstly, it was necessary to develop a new enzyme immobilization technique which would be applicable to a number of different enzymes. This technique is based on covalent bonding between the enzyme and the linking agent: glutaraldehyde. The method consists first of enzyme adsorption and then of deposition by vaporisation of the linking agent onto the sensitive end of pH glass electrodes. This immobilisation technique ensures a very short response time of the biosensor. Such performance is an undeniable advantage for continuous measurement by methods such as FIA. We then designed several FM systems which incorporate three different detection cells, each configured to specific analytical needs. Pencillin and urea electrodes, prepared using the above technique, were installed and used in these cells. The biosensor-FIA systems thus developed require neither an enzyme reactor nor reactants. In addition to this, the very short response time of the biosensors together with the advantages of the FM system and the specific properties of the detection cells lead to a high sample throughput. This analysis system was applied to the on-line measurement of the penicillin concentration during its production by fermentation and to automatic measurements of the urea concentration in human serum samples. For this, we have automated the biosensor-FIA system and designed a new stirred-flow detection cell for the installation of the penicillin and urea electrodes. This biosensor-FIA system gives satisfactory results for the determination of urea and has proved especially performant in both off- and on-line monitoring of penicillin concentration during its production in several fermentations (each run-time was approximately 250 hrs). In a direct comparison with a classical analytical method (KPLC), the biosensor-FIA system was shown to be preferable due to a combination of its on-line measurement possibilities together with its reliability, simplicity and low cost. In making possible the immediate use of the penicillin concentration by the central computer in a fermentation installation, the biosensor-FIA system is an important step towards better control and modelisation of bioprocesses.
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Les biocapteurs ampérométriques décrits dans ce travail sont basés sur l'immobilisation d'enzymes oxydo-réductases dans un polymère conducteur déposé à la surface des électrodes. Les performances des biocapteurs sont conditionnées par la méthode d'immobilisation mise en œuvre ainsi que par les caractéristiques de la matrice qui en résulte. Une technique de polymérisation électrochimique a été utilisée pour fixer l'enzyme dans un dérivé du polythiophène, le poly(3,4-éthylenedioxythiophène) (PEDT). Les potentialités de cette technique ont été démontrées pour deux enzymes différentes : la glucose oxydase et la polyphénol oxydase. L'optimisation des paramètres opérationnels a été conduite d'abord en système batch, puis étendue au système d'analyse en flux continu (FIA). Ce système biocapteur-FIA est très adapté pour des mesures en continu du glucose dans les échantillons biologiques. La sélectivité de ce biocapteur en présence de composés interférents a été améliorée par la platinisation de l'électrode, qui rehausse la réponse au glucose, ou l'utilisation des médiateurs rédox. Un biocapteur à polyphénol oxydase exploitant l'amplification enzymatique mise en jeu a permis la détection des polluants phénoliques jusqu'à 50 nM.
Author: Jacques Beaux Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 0
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L'étude du comportement des enzymes immobilisées, au moyen de capteurs, a été effectuée grâce à la réalisation d'électrodes enzymatiques fiables, ayant des réponses reproductibles dans le temps. Ces capteurs ont permis de vérifier les résultats de l'étude fondamentale qui débouche ainsi sur la compréhension détaillée des phénomènes essentiels se déroulant au sein de la membrane enzymatique. La méthode mathématique que nous avons adoptée a permis de résoudre un certain nombre de problèmes, en particulier la détermination des paramètres d'une matrice enzymatique, conditionnant le transfert de masse dans les réacteurs biologiques, et la mise en évidence de la "frontière libre" délimitant une zone "gelée". Ainsi nous avons pu expliquer des phénomènes couramment observés en pratique : Comportement de l'enzyme immobilisée vis à vis du pH, de la température, de la dénaturation et face au vieillissement. Ces connaissances devraient permettre de prévoir l'action des agents dénaturants pouvant affecter le fonctionnement des réacteurs bi0logiques et d'en améliorer les performances. Nous avons ensuite abordé l'étude du comportement des enzymes en présence des inhibiteurs, étant donné qu'ils sont les principaux effecteurs de la réaction enzymatique. Les essais cinétiques réalisés avec des enzymes en solution ne correspondaient pas à une approche exacte, compte tenu du temps souvent long, nécessaire pour séparer l'enzyme de ses inhibiteurs par dialyse, perméation sur gel, ... Les électrodes munies de membranes contenant des enzymes immobilisées, constituent le moyen idéal pour pallier à cet inconvénient, car nous pouvons à tout instant, mettre l'enzyme en présence ou non de l' inhibiteur. Cette étude a débouché sur la mise en évidence directe du phénomène de réversibilité de l'action d'un inhibiteur. Face aux inhibiteurs non réversibles immédiatement, nos recherches ont conduit à l'utilisation de substances autorisant la régénération rapide et efficace de l'enzyme inhibée. L'étude mathématique appliquée aux inhibiteurs, a permis de différencier les grands types d'inhibition, les méthodes classiques de transformation linéaires telles que celles de Lineweaver-Burk n'ayant plus de raison d'être en phase hétérogène, car les hypothèses de base ne sont plus vérifiées, les enzymes ne fonctionnant pas dans les mêmes conditions (concentrations en substrat, pH, ...) en tout point de la membrane. Le couplage de cette étude fondamentale avec les possibilités de régénération a abouti à la mise au point d'électrodes pour le dosage d'inhibiteurs. Cette méthode de dosage constitue une reproduction du phénomène naturel d'inhibition de notre organisme par des composés polluants. D'autre part, nous avons mis en évidence la possibilité de masquer les effets des inhibiteurs par un choix de conditions telles que l'activité apparente de la membrane enzymatique soit conservée. Le dosage de l'urée sanguine, en présence d'ions fluorures, en est l'exemple le plus marquant. Les capteurs enthalpimétriques nous semblaient être la solution quasi universelle au dosage des composés biologiques, toute réaction s'accompagnant en général d'une variation de l'enthalpie libre. Cependant avec le bruit de fond actuel observé au niveau de tels capteurs, seules quelques substances peuvent donner lieu à un dosage significatif. Nous avons volontairement limité notre étude à un certain nombre de paramètres qui nous ont permis d'obtenir une concordance suffisante entre les prévisions mathématiques et les résultats expérimentaux. D'autres paramètres, affectant l'activité enzymatique, pourraient être mis en évidence dans d'autres conditions expérimentales et font l'objet d'études au sein de notre laboratoire [Thèse Didier Vallin, 1984]. Les progrès réalisés, de nos jours, tant au niveau industriel, qu'agricole, s'accompagnent souvent d'une perte de la qualité de notre environnement. On connaît la pollution des eaux par les rejets industriels et les pesticides, et les conséquences parfois dramatiques aussi bien sur la faune, la flore et,... l'être humain. Aussi l'Homme a-t-il besoin de maîtriser son avenir par une meilleure connaissance des nuisances possibles pouvant provenir d'une amélioration forcenée de sa condition de vie. Aussi, je pense que les électrodes à enzymes immobilisées mises au point, tant pour le dosage des substrats que des inhibiteurs, participent à la réalisation de cet objectif. La qualité de la vie ne doit pas être un vain mot dans les années à venir.
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Les biocapteurs constituent un défi pour le diagnostic médical, la surveillance des eaux naturelles ...Dans ce travail, nous avons défini les conditions de précipitation de la structure Hôte par hydrolyse thermique de l'urée. Une nouvelle voie de synthèse d'HDL a été mise au point, utilisant la décomposition catalytique de l'urée par l'uréase. Une étude comparative des procédés d'immobilisation a permis de maîtriser la formation du matériau hybride et de contrôler la quantité d'uréase immobilisée, dont l'activité catalytique a été étudiée. L'élaboration des biocapteurs sous forme de multicouches nanostructurées HDL-Uréase a été réalisée par la technique Langmuir-Blodgett, et leur réponse a été évaluée. Cette première étude sur le confinement de protéines sur des matrices HDL, depuis l'élaboration de la matrice hôte jusqu'à la réalisation du biocapteur fonctionnel, ouvre des perspectives sur l'immobilisation d'autres enzymes et l'optimisation de films hybrides à propriétés biologiques
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CE MEMOIRE PRESENTE UNE ETUDE APPROFONDIE DES CAPACITES DES ELECTRODES A PATE DE CARBONE MODIFIEES, A OPERER DANS DES CONDITIONS DYNAMIQUES, PLUS PRECISEMENT EN ANALYSE PAR INJECTION EN FLUX CONTINU (FIA). L'OBJECTIF PRINCIPAL DE CE TRAVAIL RESIDE DANS LA MISE AU POINT DE BIOCAPTEURS AMPEROMETRIQUES PERFORMANTS POUR LE DOSAGE DU GLUCOSE EN FIA. L'ELECTRODE A PATE DE CARBONE, MODIFIEE PAR L'ENZYME GLUCOSE OXYDASE (GOD) ET LE MEDIATEUR FERROCENE (FCH), OPTIMISEE POUR LE DOSAGE DU GLUCOSE EN CONDITIONS STATIONNAIRES, N'EST PAS PERFORMANTE EN FIA, A CAUSE DE LA FUITE DE SES DIFFERENTS COMPOSANTS, ET D'UN PROBLEME DE GONFLEMENT DE SURFACE. SUITE A UNE MEILLEURE RETICULATION DE L'ENZYME, A UN CHANGEMENT DE LA NATURE DU LIANT, A L'INCORPORATION D'UN SURFACTANT, POUR AUGMENTER LA SOLUBILISATION DU FCH, ET SURTOUT SUITE A L'APPLICATION D'UN FAIBLE POTENTIEL (0 V / AG/AGCL), QUI MINIMISE LA FUITE DU MEDIATEUR, IL A ETE POSSIBLE D'OPTIMISER UN BIOCAPTEUR, PRESENTANT DES PERFORMANCES ANALYTIQUES ACCEPTABLES. AU COURS DE CE TRAVAIL, UN PHENOMENE DE PRECONCENTRATION OU EFFET EPONGE DE L'HYDROXYMETHYL FERROCENE (FCCH 2OH), A ETE OBSERVE PAR VOLTAMMETRIE CYCLIQUE, SUITE A FAIBLE POTENTIEL, SUR UNE ELECTRODE A PATE DE CARBONE MODIFIEE PAR DES PROTEINES (GOD-BSA). L'ACCUMULATION SE FAIT A PRIORI PAR LE LIANT, MAIS LE ROLE IMPORTANT DES PROTEINES SERA EGALEMENT DISCUTE. ENFIN, UNE AUTRE ALTERNATIVE A ETE PROPOSEE POUR DEVELOPPER UN BIOCAPTEUR, BASE SUR UNE ELECTRODE A PATE DE CARBONE, APPLICABLE POUR LE DOSAGE DU GLUCOSE EN FIA. L'INTRODUCTION DE L'ENZYME PEROXYDASE (HRP) DANS LE SYSTEME (GOD-FCH), PERMET UNE DETECTION EN REDUCTION DU MEDIATEUR, QUI LIMITE AINSI SA FUITE EN SOLUTION AQUEUSE.
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L'UTILISATION DE MONOMERES PYRROLIQUES FONCTIONNALISES ELECTROPOLYMERISABLES AFIN D'IMMOBILISER DES BIOMOLECULES (ENZYMES, METABOLITES) A CONDUIT A LA CREATION DE NOUVEAUX BIOMATERIAUX D'ELECTRODE. LES PROPRIETES D'ECHANGE D'ANIONS DES FILMS DE POLY(PYRROLE AMMONIUM) ET POLY(PYRROLES VIOLOGENE) ONT ETE UTILISEES POUR L'IMMOBILISATION ET L'ACTIVATION ELECTROCHIMIQUES D'UN COENZYME AINSI QUE POUR L'INCORPORATION ET LA LIBERATION ELECTROCHIMIQUEMENT CONTROLEE D'ADENOSINE TRIPHOSPHATE ET D'ACIDE 3 ;4 DIHYDROXYPHENYLACETIQUE. UNE NOUVELLE TECHNIQUE D'IMMOBILISATION D'ENZYMES A PARTIR DE MONOMERES PYRROLES AMMONIUMS AMPHIPHILES A ETE DEVELOPPEE GRACE A LEURS PROPRIETES DE DISPERSION, D'ADSORPTION ET D'ELECTROPOLYMERISATION SOUS LEUR FORME ADSORBE EN MILIEU AQUEUX. CES BIOMATERIAUX D'ELECTRODE ONT ETE APPLIQUES A LA DETECTION DE PHENOLS, GALACTOSIDES ET DE L GLUTAMATE VIA L'IMMOBILISATION DE POLY PHENOL OXYDASE, GALACTOSE OXYDASE ET DE GLUTAMATE OXYDASE. LES PERFORMANCES ANALYTIQUES DES BIOCAPTEURS AMPEROMETRIQUES ONT ETE MODULEES EN MODIFIANT LA STRUCTURE DU BIOMATERIAUX. DE PLUS, LE TRANSFERT D'ACTIVITE EN MILIEU ORGANIQUE A ETE EXEMPLIFIE PAR LA DETECTION DE PHENOL DANS CHC13. PAR AILLEURS, LA MINIATURISATION DES BIO ELECTRODES A ETE ENTREPRISE AVEC SUCCES POUR LE BIOCAPTEUR A GLUTAMATE. LA SYNTHESE DE NOUVEAUX AMPHIPHILES PYRROLIQUES FONCTIONNALISES PAR UN GROUPE VIOLOGENE A PERMIS LA REALISATION D'UN BIOCAPTEUR A NITRATE, GRACE A LA CONNEXION ELECTRIQUE DIRECTE ENTRE LA NITRATE REDUCTASE ET LE POLYMERE. LA SOPHISTICATION ET LA MODULATION DE LA COMPOSITION DU BIOMATERIAU ONT PERMIS SON OPTIMISATION
Author: Satish Kumaran
Author: Satish Kumaran
Author: Silvia Fabiano
Author: Helmut Meier
Author: Silvia Fabiano
Author: Jacques Beaux
Author: Stéphanie Vial
Author: ANITA.. RONDEAU
Author: Christophe Innocent![Réalisation d'un biocapteur pour le dosage du glucose par l'immobilisation de la glucose oxydase dans un film de polypyrrole sur une électrode de platine et comportement cinétique de l'enzyme [microforme] PDF](https://books.google.com/books/content/images/frontcover/jESjtgAACAAJ?fife=w80-h100)
Author: Brassard, Éric
Author: Éric Brassard