GAIN DE SENSIBILITE EN SPECTROMETRIE DE MASSE DES BIOMOLECULES UTILISATION DE L'IONISATION ELECTROSPRAY ET DE LA DESORPTION LASER ASSISTEE PAR MATRICE POUR LA CARACTERISATION DE PROTEINES ET DE MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES PDF Download
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE EST AUJOURD'HUI DEVENUE UNE TECHNIQUE INCONTOURNABLE POUR LA RECHERCHE EN BIOCHIMIE. ELLE A CONNU CES DIX DERNIERES ANNEES, UN ESSOR CONSIDERABLE DANS LA CARACTERISATION DES BIOMOLECULES ET EN PARTICULIER DANS L'ANALYSE DES PEPTIDES ET DES PROTEINES. CE TRAVAIL DE THESE A ETE ORIENTE SIMULTANEMENT DANS DEUX DIRECTIONS. NOUS AVONS D'UNE PART PROGRESSE DANS L'UTILISATION DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR OBTENIR DES DONNEES STRUCTURALES, PRINCIPALEMENT EN FOCALISANT SUR L'AMELIORATION DE LA METHODE POUR ATTEINDRE LE DOMAINE SUB-PICOMOLAIRE. NOUS AVONS AMELIORE : - LA SENSIBILITE EN NANOES-MS A L'AIDE D'UN BANC D'ESSAI PERMETTANT L'EVALUATION DU CAPILLAIRE. - LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE EN MALDI-MS GRACE A UNE PREPARATION DE L'ECHANTILLON ADAPTEE. NOUS AVONS D'AUTRE PART, RELEVE LE DEFI QUI CONSISTAIT A RESOUDRE DES PROBLEMES DE CARACTERISATION POSES PAR LES BIOCHIMISTES AUX SPECTROMETRISTES DE MASSE, APRES EPUISEMENT DE TOUTES LES AUTRES POSSIBILITES DES ANALYSES CLASSIQUES (RMN, DEGRADATION D'EDMAN, COMPOSITION EN ACIDES AMINES, GEL D'ELECTROPHORESE). GRACE AU GAIN DE SENSIBILITE ET A L'AMELIORATION DE LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE, NOUS AVONS PU ABORDE L'ETUDE DE PROBLEMES BIOLOGIQUES REELS ET AINSI CARACTERISER : - LA PREMIERE TOXINE DE SCORPION GLYCOSYLEE, - UN PEPTIDE ANTIBACTERIEN DE CREVETTE PANAEUS VANNAMEI, - UNE NOUVELLE MODIFICATION POST-TRADUCTIONNELLE DE LA SCHISTOSOMA MANSONI P28. NOUS AVONS D'AUTRE PART : - IDENTIFIE LA KININOGENE HUMAINE, PROTEINE RESPONSABLE DE L'IMMUNOGENICITE DE LOTS DE FACTEUR VIII. CETTE ETUDE S'INSCRIT DANS LE CADRE GENERAL DU PROJET PROTEOME, - LOCALISE UN PEPTIDE MODIFIE CHIMIQUEMENT PAR PHOTOMARQUAGE LORS DE L'ETUDE DES SITES DE LIAISON DE LA BUCHE, - DETERMINE DES SITES SPECIFIQUES D'HYDROLYSE DE LA GPV ET DE RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (PAR 1, PAR 2).
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE EST AUJOURD'HUI DEVENUE UNE TECHNIQUE INCONTOURNABLE POUR LA RECHERCHE EN BIOCHIMIE. ELLE A CONNU CES DIX DERNIERES ANNEES, UN ESSOR CONSIDERABLE DANS LA CARACTERISATION DES BIOMOLECULES ET EN PARTICULIER DANS L'ANALYSE DES PEPTIDES ET DES PROTEINES. CE TRAVAIL DE THESE A ETE ORIENTE SIMULTANEMENT DANS DEUX DIRECTIONS. NOUS AVONS D'UNE PART PROGRESSE DANS L'UTILISATION DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR OBTENIR DES DONNEES STRUCTURALES, PRINCIPALEMENT EN FOCALISANT SUR L'AMELIORATION DE LA METHODE POUR ATTEINDRE LE DOMAINE SUB-PICOMOLAIRE. NOUS AVONS AMELIORE : - LA SENSIBILITE EN NANOES-MS A L'AIDE D'UN BANC D'ESSAI PERMETTANT L'EVALUATION DU CAPILLAIRE. - LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE EN MALDI-MS GRACE A UNE PREPARATION DE L'ECHANTILLON ADAPTEE. NOUS AVONS D'AUTRE PART, RELEVE LE DEFI QUI CONSISTAIT A RESOUDRE DES PROBLEMES DE CARACTERISATION POSES PAR LES BIOCHIMISTES AUX SPECTROMETRISTES DE MASSE, APRES EPUISEMENT DE TOUTES LES AUTRES POSSIBILITES DES ANALYSES CLASSIQUES (RMN, DEGRADATION D'EDMAN, COMPOSITION EN ACIDES AMINES, GEL D'ELECTROPHORESE). GRACE AU GAIN DE SENSIBILITE ET A L'AMELIORATION DE LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE, NOUS AVONS PU ABORDE L'ETUDE DE PROBLEMES BIOLOGIQUES REELS ET AINSI CARACTERISER : - LA PREMIERE TOXINE DE SCORPION GLYCOSYLEE, - UN PEPTIDE ANTIBACTERIEN DE CREVETTE PANAEUS VANNAMEI, - UNE NOUVELLE MODIFICATION POST-TRADUCTIONNELLE DE LA SCHISTOSOMA MANSONI P28. NOUS AVONS D'AUTRE PART : - IDENTIFIE LA KININOGENE HUMAINE, PROTEINE RESPONSABLE DE L'IMMUNOGENICITE DE LOTS DE FACTEUR VIII. CETTE ETUDE S'INSCRIT DANS LE CADRE GENERAL DU PROJET PROTEOME, - LOCALISE UN PEPTIDE MODIFIE CHIMIQUEMENT PAR PHOTOMARQUAGE LORS DE L'ETUDE DES SITES DE LIAISON DE LA BUCHE, - DETERMINE DES SITES SPECIFIQUES D'HYDROLYSE DE LA GPV ET DE RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (PAR 1, PAR 2).
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CE TRAVAIL DE THESE MONTRE L'INTERET DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A DESORPTION/IONISATION LASER ASSISTEE PAR MATRICE (MALDI-TOF MS) COMME OUTIL D'ANALYSE STRUCTURALE DES PROTEINES. LE PRINCIPAL OBJECTIF DE CE TRAVAIL ETAIT D'AMELIORER LES PERFORMANCES DE CETTE TECHNIQUE D'IONISATION AFIN DE L'INTEGRER DANS LES STRATEGIES D'ANALYSE DU LABORATOIRE. LA PREMIERE PARTIE PRESENTE LE PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT D'UNE SOURCE MALDI ET D'UN ANALYSEUR A TEMPS DE VOL (TOF) AVEC UNE ATTENTION PARTICULIERE PORTEE SUR LES PARAMETRES CONDITIONNANT LA RESOLUTION ET LA QUALITE DES SPECTRES MALDI-TOF. LA PARTIE RESULTATS PRESENTE LE DEVELOPPEMENT D'APPROCHES ANALYTIQUES NOUVELLES BASEES SUR LA TECHNIQUE D'IONISATION MALDI ET LEUR APPLICATION A DES PROBLEMES DE BIOCHIMIE ANALYTIQUE DIFFICILES A RESOUDRE AVEC LES TECHNIQUES USUELLES TELS QUE (I) LA LOCALISATION RAPIDE DE SITES DE CLIVAGE PROTEOLYTIQUES D'ENZYMES PEU SPECIFIQUES (PROTEASES LEUCOCYTAIRES, CATHEPSINES) SUR DES PROTEINES MEMBRANAIRES (RECEPTEUR PLAQUETTAIRES, APP) (II) L'IDENTIFICATION PRECOCE DE MOLECULES INDUITES (PEPTIDES ANTIBACTERIENS D'INSECTES, HORMONE ANDROGENE DE CRUSTACE) DIRECTEMENT A PARTIR DU TISSUS OU DU FLUIDE DANS LEQUEL ELLES SONT PRODUITES OU VEHICULEES (III) LA VERIFICATION DE L'INTEGRITE DES MOLECULES (DIPTERICINE, HORMONE ANDROGENE) AU COURS DE LEUR PURIFICATION (IV) LA DETERMINATION DE L'HETEROGENEITE DE GLYCOSYLATION DE PROTEINES RECOMBINANTES (HLH, HFSH) (V) LA DETERMINATION DE LA STOECHIOMETRIE DE COMPLEXATION DE PROTEINES MULTIMERIQUES DE HAUT POIDS MOLECULAIRE (HEMOLYSINE, AEROLYSINE). LES DONNEES PRESENTEES DEMONTRENT QUE L'OBTENTION ET LA QUALITE DES RESULTATS PASSENT PAR LA MAITRISE DE L'ETAPE DE PREPARATION DE L'ECHANTILLON. UN MEILLEUR CONTROLE DES DIFFERENTS PARAMETRES DE COCRISTALLISATION DE L'ECHANTILLON AVEC LA MATRICE PERMET DES AMELIORATIONS SIGNIFICATIVES EN TERME DE SENSIBILITE, DE RESOLUTION ET DE PRECISION SUR LA MASSE.
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LA TECHNIQUE DE SPECTROMETRIE DE MASSE PAR TEMPS DE VOL EST ACTUELLEMENT UN OUTIL TRES PERFORMANT POUR L'ANALYSE D'IONS MOLECULAIRES DE MASSES ELEVEES (100 000 U ET PLUS). LE PASSAGE EN PHASE GAZEUSE ET L'IONISATION DE TELLES MOLECULES SONT DEVENUS POSSIBLES GRACE A LA TECHNIQUE DE PRODUCTION DES IONS APPELEE MALDI (MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION). ELLE CONSISTE A MELANGER LES MACROMOLECULES AVEC UNE MATRICE ORGANIQUE AYANT POUR PROPRIETE D'ABSORBER A LA LONGUEUR D'ONDE DU LASER UTILISE. UN DEPOT SOLIDE DU MELANGE EST ENSUITE SOUMIS A DES TIRS LASER PULSES QUI EJECTENT LES MACROMOLECULES INTACTES EN GRAND NOMBRE. DES ETUDES FONDAMENTALES SUR LES PROCESSUS DE DESORPTION-IONISATION ONT ETE EFFECTUEES. NOUS AVONS MIS EN EVIDENCE QUE LE CHOIX DE LA MATRICE INFLUENCE BEAUCOUP LE TYPE D'IONS FORMES (MULTIMERES OU MULTICHARGES) ET LEUR METASTABILITE. DES IRRADIANCES LASER FAIBLES, DE QUELQUE 10#6 W/CM#2, SONT NECESSAIRES. DANS CES CONDITIONS, NOUS MONTRONS QUE LES RESOLUTIONS EN MASSE SONT OPTIMALES ET QUE LA PRECISION RELATIVE OBTENUE SUR LES VALEURS DES MASSES MOLECULAIRES ATTEINT QUELQUE 10#-#4 (SOIT 5 U POUR DES MASSES DE L'ORDRE DE 30 000 U). NOUS AVONS EGALEMENT MIS EN EVIDENCE QUE L'ANGLE D'EMISSION DES IONS MOLECULAIRES EN MALDI DEPEND DE L'ANGLE D'INCIDENCE DE LA LUMIERE LASER. AU COURS DES PROCESSUS D'EJECTION, LES IONS MOLECULAIRES SONT EMIS DANS LA DIRECTION INVERSE DE LA LUMIERE LASER. CET EFFET EST PARTICULIEREMENT IMPORTANT POUR LA CONCEPTION DE L'ESPACE ACCELERATEUR DES IONS MOLECULAIRES DANS LES SPECTROMETRES DE MASSE A TEMPS DE VOL. LES PROBLEMES LIES A LA DETECTION DE CES IONS MOLECULAIRES DE HAUTES MASSES ONT AUSSI ETE ETUDIES EN DETAIL. UNE VALEUR SEUIL EN VITESSE D'IMPACT DE L'ORDRE DE 0,5.10#4M/S A PU ETRE DETERMINEE POUR L'EMISSION ELECTRONIQUE. ENFIN, DES EXEMPLES D'APPLICATIONS SUR L'IDENTIFICATION EN MASSE DE MOLECULES DE C#6#0 ET DE MOLECULES DERIVEES (PAR EXEMPLE C#6#0F#X) SONT PRESENTES ET DIFFERENTES TECHNIQUES DE PRODUCTION DES IONS SONT COMPAREES
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Ce travail porte sur la fabrication d'un support inorganique de nanofils de silicium dédié à la détection sensible de biomolécules par désorption/ionisation laser (LDI) en spectrométrie de masse (MS). Cette technique, contrairement à l'analyse LDI assistée par matrice (MALDI), permet de s'affranchir des ions parasites de la matrice organique qui interfèrent avec les molécules de masses inférieures à 700 Da. Le support de nanofils optimal montre une haute sensibilité de détection des molécules de petites masses (50 fois supérieure au MALDI), il s'adapte à des analyses protéomiques et nous a permis d'instaurer un contrôle complémentaire au suivi de la réaction de méthylation pour la conception d'une biopuce à peptides. Le support s'intègre dans un laboratoire sur puce: une goutte d'1 μL d'un mélange de peptide (50.10-15M) a été déplacée par microfluidique discrète (électromouillage sur diélectrique) puis analysée avec succès par LDIMS.
Author: Aurélie Même Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 197
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Compte tenu de l’omniprésence des interactions non-covalentes en chimie et en biologie, leur étude est devenue incontournable. Les techniques analytiques les plus fréquemment utilisées comme la RMN et la cristallographie RX sont difficiles voire impossibles à mettre en œuvre pour l’analyse de certains édifices non-covalents. De nouveaux outils analytiques sont par conséquent nécessaires pour résoudre ces problématiques. Lors de ce travail de thèse, nous avons donc évalué le potentiel de la spectrométrie de masse et notamment de deux techniques d’ionisation douce : l’ionisation électrospray (ESI-MS) et l’Ionisation/Désorption Laser Assistée par Matrice (MALDI-MS). Ce travail s’est articulé selon trois axes : i) l’analyse d’édifices neutres, insolubles ou solubles dans des solvants très volatils comme le dichlorométhane ou le chloroforme : ces analytes offrent l’opportunité de tester une approche par MALDI-MS comme alternative à l’ESI-MS, ii) l’étude in vivo et in vitro d’une petite molécule à visée thérapeutique, le myo-Inositol trispyrophosphate (ITPP), dans le sang : cette étude doit permettre de mieux comprendre le mécanisme de régulation de l’ITPP, iii) l’étude du complexe Adx/AdR, impliqué dans la biosynthèse des stéroïdes chez les vertébrés : la mesure des constantes de stabilité des complexes formés à partir de variants d’Adx doit permettre de mieux comprendre le mécanisme d’interaction entre ces deux partenaires redox lors du transfert d’électron.
Author: Gaëlle Piret Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 233
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Ce travail porte sur la fabrication d’un support inorganique de nanofils de silicium dédié à la détection sensible de biomolécules par désorption/ionisation laser (LDI) en spectrométrie de masse (MS). Cette technique, contrairement à l’analyse LDI assistée par matrice (MALDI), permet de s’affranchir des ions parasites de la matrice organique qui interfèrent avec les molécules de masses inférieures à 700 Da. La littérature fait état de la difficulté à déterminer les paramètres liés à la performance de la technique : nous avons varié la morphologie, la composition, la chimie de surface des nanofils de silicium et nous avons discuté de l’importance des propriétés optiques et thermiques, de la mouillabilité de surface et de l’accessibilité des molécules au faisceau laser. Le support de nanofils optimal montre une haute sensibilité de détection des molécules de petites masses (50 fois supérieure au MALDI), il s’adapte à des analyses protéomiques et nous a permis d’instaurer un contrôle complémentaire au suivi de la réaction de méthylation pour la conception d’une biopuce à peptides. Nous avons finalement travaillé sur l’intégration de ce support dans un laboratoire sur puce. Une goutte d’1 μL d’un mélange de peptide (50.10-15M) a été déplacée par microfluidique discrète (électromouillage sur diélectrique) puis analysée avec succès par LDIMS. Finalement, nous avons développé une méthode originale combinant la chimie et la topographie de surface des nanofils de silicium à des techniques de lithographie optique : des zones de différentes tensions de surface liquide/solide sont ainsi créées et sont favorables à l’adhésion localisée de protéines, de cellules et de bactéries.
Author: NATHALIE.. CARTE Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 307
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LA RECENTE INNOVATION INSTRUMENTALE DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A PERMIS D'ETENDRE LES POSSIBILITES DE LA TECHNIQUE D'ANALYSE EN AMELIORANT LES PERFORMANCES, ET EN ACCEDANT GRACE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE TANDEM (MS 2) A DES INFORMATIONS STRUCTURALES FINES CARACTERISTIQUES DES MOLECULES ANALYSEES. L'OBJECTIF DE CE TRAVAIL A ETE D'EVALUER LES POSSIBILITES D'UNE NOUVELLE GENERATION DE SPECTROMETRE DE MASSE CAPABLE D'EFFECTUER DES ANALYSES MS N ; L'ESQUIRE-LC CONSTITUE D'UN ANALYSEUR TRAPPE IONIQUE (IT) COUPLE A UNE SOURCE ELECTROSPRAY (ES). LA PREMIERE PARTIE DU MANUSCRIT PRESENTE LA CARACTERISATION DES BIOMOLECULES PAR MS ET MS N ET PRECISE LES INFORMATIONS STRUCTURALES OBTENUES (CHAPITRE I). APRES AVOIR OPTIMISE L'ESQUIRE-LC (CHAPITRE II), NOUS AVONS ADAPTE DES STRATEGIES D'ANALYSES NANOES-MS N A CHAQUE ETUDE ABORDEE DANS LE CHAPITRE III. NOUS AVONS AINSI MIS EN EVIDENCE, DES MODIFICATIONS PROTEIQUES (ANALYSE PROTEOMIQUE ET ANALYSE DE NOUVEAUX VARIANTS D'HEMOGLOBINE), CARACTERISE UNE MODIFICATION ENGENDREE PAR UN INHIBITEUR SUR UNE ENZYME (L'ADOHCY HYDROLASE), SEQUENCE DE NOVO UN PEPTIDE N-BLOQUE ISSU DE LA DROSOPHILE ET ACCEDE AUX STRUCTURES COMPLEXES DES GLYCOSYLATIONS PROTEIQUES. LA DEUXIEME PARTIE DU MANUSCRIT PRESENTE DES ETUDES DE CARACTERISATION D'EDIFICES NON-COVALENTS BIOLOGIQUES QUI NECESSITENT DES PRECAUTIONS D'ANALYSE MS MINUTIEUSES (CHAPITRE I). NOTRE OBJECTIF ETAIT DE DETERMINER PREALABLEMENT LES CONDITIONS INSTRUMENTALES ADEQUATES DE L'ESQUIRE-LC, PROPICES AU MAINTIEN DES INTERACTIONS FAIBLES EN PHASE GAZEUSE ET A L'INTEGRITE DE L'EDIFICE NON-COVALENT (CHAPITRE II). TRES PRISEE PAR LES BIOLOGISTES, LA MS SUPRAMOLECULAIRE NOUS A PERMIS D'EVALUER LA SELECTIVITE DU CIS PLATINE POUR L'ADN (CHAPITRE III). CE TRAVAIL SOULIGNE L'INTERET DE LA MS N PAR ES-IT POUR L'ELUCIDATION STRUCTURALE DES BIOMOLECULES. IL EST CEPENDANT PRIMORDIAL DE MAITRISER LES DIFFERENTS PARAMETRES INSTRUMENTAUX QUI FACILITENT L'OBTENTION DES INFORMATIONS MAIS SURTOUT LEUR QUALITE.
Author: DAMARYS.. LOEW
Author: DAMARYS.. LOEW
Author: MARC.. MONIATTE
Author: PIERRE.. CHAURAND
Author: PIRET-G.
Author: Aurélie Même
Author: Gaëlle Piret
Author: NATHALIE.. CARTE