Etude structurale par spectroscopie de RMN du domaine CAT-PRD1 de la protéine LicT de Bacillus subtilis PDF Download
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Author: Thierry Ducat Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 183
Book Description
LicT is a protein of the BglG/SacY family from Bacillus subtilis. It regulates, by a transcriptional antitermination mecanism, the expression of the licS gene involved in the β-glucosides metabolism. Once activated, LicT prevents transcriptional termination by fixation to its RNA target. LicT is a modular protein constituted by an RNA binding domain, CAT (Co- Antiterminator) and a regulatory domain, PRD (PTS Regulation Domain) composed of two homologous domains PRD1 and PRD2. The structures of the isolated CAT and PRD domains were recently resolved. Then, the structure of the CAT-PRD1 domain (LicTl-167) is now essential to the understanding of the transmission of the regulation signals between regulator and effector domains. CAT-PRD1 domain was successfully produced and purified. The precipitation of the NMR samples has led us to set up a methodology for the determination of solubility and stability conditions of proteins. Then, CAT-PRD1 domain was identified in solution as a symetrical homodimer of 40 kDa. Its 2H, 13C and 15N labelling has enabled the backbone resonance assignment and the identification of an α-helical folding of the linker region between the CAT and PRD1 domains. Structural variations induced by PRD1 domain on CAT domain were localised. Only the dimer interface of CAT domain was affected and suggests the opening or reorientation of the CAT monomers. The destabilising effect of PRD1 domain was specified. It would shift the equilibrium defined in the regulation model of LicT toward its inactive forms. The α-helix linker between CAT and PRD1 domains would have a central role in the inactivation of the LicT protein and in the transmission of the regulation signals. A preliminary model of CAT PRD1 domain based on relaxation data is presented and shows the monomerisation of CAT domain.
Author: Thierry Ducat Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 183
Book Description
LicT is a protein of the BglG/SacY family from Bacillus subtilis. It regulates, by a transcriptional antitermination mecanism, the expression of the licS gene involved in the β-glucosides metabolism. Once activated, LicT prevents transcriptional termination by fixation to its RNA target. LicT is a modular protein constituted by an RNA binding domain, CAT (Co- Antiterminator) and a regulatory domain, PRD (PTS Regulation Domain) composed of two homologous domains PRD1 and PRD2. The structures of the isolated CAT and PRD domains were recently resolved. Then, the structure of the CAT-PRD1 domain (LicTl-167) is now essential to the understanding of the transmission of the regulation signals between regulator and effector domains. CAT-PRD1 domain was successfully produced and purified. The precipitation of the NMR samples has led us to set up a methodology for the determination of solubility and stability conditions of proteins. Then, CAT-PRD1 domain was identified in solution as a symetrical homodimer of 40 kDa. Its 2H, 13C and 15N labelling has enabled the backbone resonance assignment and the identification of an α-helical folding of the linker region between the CAT and PRD1 domains. Structural variations induced by PRD1 domain on CAT domain were localised. Only the dimer interface of CAT domain was affected and suggests the opening or reorientation of the CAT monomers. The destabilising effect of PRD1 domain was specified. It would shift the equilibrium defined in the regulation model of LicT toward its inactive forms. The α-helix linker between CAT and PRD1 domains would have a central role in the inactivation of the LicT protein and in the transmission of the regulation signals. A preliminary model of CAT PRD1 domain based on relaxation data is presented and shows the monomerisation of CAT domain.
Author: Dries Verdegem Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 410
Book Description
De nombreuses protéines ou domaines de protéines sont intrinsèquement non structurés/désordonnés (IUPs), mais possèdent néanmoins des fonctions diverses et importantes in vivo. La technique de choix pour étudier les IUPs est la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Cependant, pour obtenir de l'information à partir des différentes expériences de RMN possibles, les spectres doivent d'abord être attribués. Pour faciliter cette attribution, un outil graphique, semi-automatique qui utilise le concept des plans produit et somme a été développé. Cet outil a permis l'étude de deux IUPs individuelles, Tau et NS5A VHC. Les résonances RMN du squelette et des Cb ont été attribuées entièrement pour deux fragments de Tau (F3 et F5) et partiellement pour Tau entier P301L. Ces attributions RMN de Tau pourraient mener à davantage de compréhension sur le comportement structural de cette protéine quand elle se lie à, ou polymérise des microtubules. Aussi la formation des agrégés de Tau, qui est une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, pourrait être étudiée plus en détail. Dans un deuxième temps, la protéine non structurale 5A (NS5A) du virus de l'Hépatite C (VHC) a été étudiée. Les propriétés structurales du deuxième et troisième domaine (sur trois) de cette protéine ont été évaluées. De la structure hélice alpha résiduelle a été observée, ce qui pourrait indiquer des régions prédisposées à interagir avec d'autres partenaires cellulaires. On a également examiné l'interaction entre CypA et CypB et les domaines D2 et D3 de NS5A, car ces PPIases pourraient jouer un rôle dans la réplication de VHC.
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Les protéines Myb sont des facteurs de transcription capables de contrôler la différentiation et la prolifération cellulaire. Il ne fait aujourd'hui aucun doute que les activités importantes des protéines Myb sont déterminées par leurs domaines fonctionnels. La spectroscopie RMN hétéronucléaire multidimensionnelle a été utilisée pour étudier le domaine de liaison minimale à l'ADN de la protéine v-Myb (R2R3 v-Myb) en phase aqueuse. Nous avons ainsi attribué la quasi-totalité de cette protéine. A l'aide des effets structurants secondaires, nous avons pu estimer les régions hélicoi͏̈dales de cette protéine. Comme pour toutes les protéines Myb étudiées structuralement jusqu'à présent, la répétition R3 de ce domaine présente effectivement trois hélices ? entre les résidus Glutamate 62 - Leucine 75, Tryptophane 79 - Lysine 84, Thréonine 91 - Sérine 100. Mais le domaine R2 de cette protéine semble avoir une structuration différente que celle déjà observées pour d'autres protéines Myb (C-Myb humain/poulet et B-Myb poulet). Ces protéines présentaient en effet une structuration en conformation multiple en partie C-Terminal de ce domaine alors que notre étude nous montre une structuration effective en hélice ? de cette région. Cette structuration avait déjà été observée pour la protéine C-Myb souris. La structuration de notre protéine se rapprocherait donc plus de celle mentionnée pour cette dernière. Il semble donc que la structure seule de ces protéines n'explique pas les différences d'activités biologiques observées pour v-Myb par rapport aux autres protéines Myb (notamment C-Myb souris)
Author: Abdelnasser El Ghazouani Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 206
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La métalloprotéine PerR (Peroxyde resistance Regulator), homodimère de 2 fois 16,5 kDa, est un facteur de la transcription. PerR est le senseur du peroxyde d'hydrogène chez plusieurs microorganismes. PerR de Bacil/us subtilis a été isolée sous sa forme apo avec la présence d'un ion Zn2+ par monomère. Dans des conditions de culture non contrôlées, PerR est en partie oxydée de manière aléatoire. La spectrométrie de masse et la spectroscopie RPE nous ont permis de relier la capacité de fixation du métal régulateur (Fe2+ ou Mn2l et l'oxydation de PerR. Notre travail a permis de mettre au point un protocole d'expression conduisant de manière reproductible à une forme totalement réduite. Ceci a permis la détermination précise de l'affInité de la protéine pour le métal régulateur et l'ADN. La forme apo-PerR-Zn a été cristallisée et cette structure révèle un site structural à zinc avec une coordination tétraédrique par les quatre cystéines de la protéine (motif Zn(Cys)4)' Ce site verrouille le domaine de dimérisation, favorisant ainsi la stabilité du dimère. Le rôle structural de ce site a été confirmé par des expériences biochimiques qui mettent en évidence une réactivité faible vis-à-vis d'H202. Des études en spectroscopie de fluorescence ont montré des changements conformationnels de PerR en solution après métallation et fixation à l'ADN. La formation du complexe ADN-PerR a été étudiée de manière détaillée et a permis de mettre en évidence deux nucléotides et trois acides aminés essentiels dans cette interaction. Enfin, nos travaux sur la forme oxydée de PerR ont mis en évidence que le résidu 2-oxo-histidine est le marqueur biologique de l'oxydation de PerR.
Author: Abdelnasser El Ghazouani Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 0
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La métalloprotéine PerR (Peroxyde resistance Regulator), homodimère de 2 fois 16,5 kDa, est un facteur de la transcription. PerR est le senseur du peroxyde d'hydrogène chez plusieurs microorganismes. PerR de Bacil/us subtilis a été isolée sous sa forme apo avec la présence d'un ion Zn2+ par monomère. Dans des conditions de culture non contrôlées, PerR est en partie oxydée de manière aléatoire. La spectrométrie de masse et la spectroscopie RPE nous ont permis de relier la capacité de fixation du métal régulateur (Fe2+ ou Mn2l et l'oxydation de PerR. Notre travail a permis de mettre au point un protocole d'expression conduisant de manière reproductible à une forme totalement réduite. Ceci a permis la détermination précise de l'affInité de la protéine pour le métal régulateur et l'ADN. La forme apo-PerR-Zn a été cristallisée et cette structure révèle un site structural à zinc avec une coordination tétraédrique par les quatre cystéines de la protéine (motif Zn(Cys)4)' Ce site verrouille le domaine de dimérisation, favorisant ainsi la stabilité du dimère. Le rôle structural de ce site a été confirmé par des expériences biochimiques qui mettent en évidence une réactivité faible vis-à-vis d'H202. Des études en spectroscopie de fluorescence ont montré des changements conformationnels de PerR en solution après métallation et fixation à l'ADN. La formation du complexe ADN-PerR a été étudiée de manière détaillée et a permis de mettre en évidence deux nucléotides et trois acides aminés essentiels dans cette interaction. Enfin, nos travaux sur la forme oxydée de PerR ont mis en évidence que le résidu 2-oxo-histidine est le marqueur biologique de l'oxydation de PerR.
Author: Lionel Cladière Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 288
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GTPases form a large family of proteins in the living world implicated in many fundamental cellular processes. My studies in this thesis have concerned the characterization of CpgA, a GTPase encoded by an essential gene (previously named, yloQ). The primary amino acid sequence of CpgA revealed the presence of G-motifs, typical of GTPases, however, unusually these are circularly permuted. The kinetic parameters of purified CpgA were determined and confirmed a specific but low GTPase activity. However, this activity is stimulated by the addition of ribosomes. Crystallization of CpgA permitted the determination of a high resolution structure at 1.6Å. The core structure of the GTPase domain is essentially identical to classical GTPases, despite the circular permutation. The structure of CpgA revealed two additional domains, an OB module and a zinc binding module which includes a novel metal coordinating site. In fact, this particular combination of modules with the G-domain is unique to bacteria. The structural features of CpgA, combined with recent detailed phylogeny analysis, is consistent with a role for CpgA in translation in protein synthesis. I have also shown using phase contrast microscopy, that an engineered reduction in the level of CpgA results in cells with abnormal morphology, in particular at low temperature. This phenotype was specifically corrected by re-introduction of a single copy of the cpgA gene. These results indicate that CpgA may be involved in the translation of subset of proteins, participating, for example, in the synthesis of the cell wall. The gene cpgA is localized downstream of two genes, prpC and prkC, encoding, respectively, a Ser/Thr protein phosphatase and a Ser/Thr protein kinase. The organization of this locus is conserved in several Gram positive bacteria, including some important pathogens. The products of these three genes could therefore play a role in the same signalling pathway.
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CE TRAVAIL SE DIVISE EN DEUX PARTIES DISTINCTES, RMN STRUCTURALE A UNE DIMENSION ET RMN METABOLIQUE A UNE ET DEUX DIMENSIONS. DANS UNE PREMIERE PARTIE, UNE ANALYSE QUANTITATIVE DE SPECTRES PHOSPHORES DE LA PROTEINE SIR-FP60 NATIVE ET DANS DES ETATS REDOX CONNUS NOUS A PERMIS D'EBAUCHER UNE STRUCTURE DU SITE ACTIF DE LA NADP SULFITE REDUCTASE (SIR). DANS UNE DEUXIEME PARTIE, LA QUANTIFICATION DES SPECTRES D'EXTRAITS ACIDES CELLULAIRES DE POINTES DE RACINES DE MAIS EXCISEES ET L'ANALYSE QUANTITATIVE D'EXPERIENCES IN-VIVO NOUS ONT PERMIS D'ETUDIER LE SIGNAL-SUCRE ET LA TRANSITION NORMOXIE-ANOXIE CHEZ LES CELLULES VEGETALES. NOUS AVONS CONFIRME LE ROLE ACTIF DES HEXOKINASES DANS LA REPONSE ADAPTATIVE DES POINTES DE RACINES DE MAIS AU MANQUE DE SUBSTRATS CARBONES EXOGENES. NOUS AVONS EGALEMENT DECRIT UN SYSTEME EXPERIMENTAL POUR L'UTILISATION D'UN TUBE RMN DE DIAMETRE 5 MM. CE SYSTEME NOUS A PERMIS D'ISOLER COMPLETEMENT LES RESONANCES DU LACTATE, DE L'ALANINE ET DES LIPIDES QUI ONT DES FREQUENCES DE RESONANCE PROTON TROP PROCHES A UNE DIMENSION POUR ETRE TOTALEMENT SEPAREES. LES MILIEUX INTERNE ET EXTERNE ONT ETE ANALYSES PAR SPECTROSCOPIE PROTON A UNE DIMENSION POUR SUIVRE LA TRANSITION BRUTALE VERS L'ANOXIE. LES EXPERIENCES RMN A DEUX DIMENSIONS SE SONT REVELEES INDISPENSABLES POUR L'IDENTIFICATION DE METABOLITES DANS DES EXTRAITS ACELLULAIRES (CAS DU GLUCOSE-1-PHOSPHATE OU DU LACTATE PAR EXEMPLE). DANS UNE TROISIEME PARTIE, LES PROPRIETES DES SEQUENCES 2D UTILISABLES IN-VIVO ONT ETE ANALYSEES ET, NOUS AVONS MONTRE L'INTERET DE LA SEQUENCE COLOC POUR LA MESURE DE LA VARIATION DE QUANTITE DE GLUCOSE-1-PHOSPHATE, IMPOSSIBLE PAR RMN A UNE DIMENSION.
Author: Thierry Ducat
Author: Thierry Ducat
Author: Ahmad Seif Kanaan
Author: Dries Verdegem
Author: Didier Rivière
Author: Abdelnasser El Ghazouani
Author: Abdelnasser El Ghazouani
Author: Lionel Cladière
Author: ADELINE.. EVRARD