Etude de différentes méthodes de biofonctionnalisation pour la réalisation de biocapteurs. Application à la détection de pesticides PDF Download
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Author: Kai Wan Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 156
Book Description
Le travail de cette thèse a consisté à étudier l'immobilisation de molécules biochimiques sur des transducteurs potentiométriques par différentes méthodes d'immobilisation, afin de réaliser des micro capteurs de type ISFET pour déterminer un pesticide organophosphoré (le trichlo fon) dans l'eau. Deux grands types d'immobilisation ont été mis au point : - le dépôt de monocouches enzymatiques par la technique Langmuir-Blodgett - le dépôt de membranes enzymatiques épaisses. Dans le cadre du dépôt de monocouches enzymatiques, nous nous sommes attachés à qualifier la présence des molécules d'enzyme (la butyrylcholine estérase) dans les films mixtes amphiphile/enzyme de Langmuir à l'interface eau/air. A partir de nos résultats, une hypothèse sur l'évolution du film mixte amphiphile/ODA à l'interface air/eau a été proposée. Nous supposons qu'il existe une réorganisation des molécules d'enzyme avec les molécules de st arylamine pour des pressions de surface comprises entre 35 mN/m et 43 mN/m. Ce processus de réorganisation est contrôlé par le temps de relaxation du film. Cette hypothèse est confirmée par la spectroscopie FTIR-ATR et l'AFM du film LB mixte. Les micro biocapteurs potentiométriques (ENFETs) pour déterminer le trichlo fon ont été réalisés par cette méthode. Ce type de biocapteur a permis d'atteindre des limites de détection de 0.1μM. Nous avons aussi effectué deux types différents de membranes enzymatiques épaisses afin de réaliser des micro capteurs pour détecter le trichlo fon. Une procédure classique basée sur l'immobilisation de l'enzyme dans le BSA suivie de sa réticulation par le glutaraldéhyde est comparée à une nouvelle procédure par piégeage de l'enzyme en utilisant une matrice de polymère photo polymérisable : le PVA/SbQ contenant du styrylpyridinium. Sur la base de ces deux types d'ENFETs, les performances analytiques (la sensibilité, la durée de vie, la dynamique.) sont comparées à partir de l'inhibition de l'enzyme. Les résultats obtenus montrent que l'immobilisation d'enzyme dans la membrane PVA/SbQ conduit à des micro capteurs présentant de meilleures caractéristiques que celles qui sont obtenues par la réticulation de l'enzyme : une plus grande dynamique linéaire de mesure dans le mode cinétique, une meilleure reproductibilité et surtout une meilleure stabilité au stockage. Les deux types d'immobilisation conduisent à des micro capteurs qui présentent la même limite de détection pour le trichlo fon : 1μM.
Author: Kai Wan Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 156
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Le travail de cette thèse a consisté à étudier l'immobilisation de molécules biochimiques sur des transducteurs potentiométriques par différentes méthodes d'immobilisation, afin de réaliser des micro capteurs de type ISFET pour déterminer un pesticide organophosphoré (le trichlo fon) dans l'eau. Deux grands types d'immobilisation ont été mis au point : - le dépôt de monocouches enzymatiques par la technique Langmuir-Blodgett - le dépôt de membranes enzymatiques épaisses. Dans le cadre du dépôt de monocouches enzymatiques, nous nous sommes attachés à qualifier la présence des molécules d'enzyme (la butyrylcholine estérase) dans les films mixtes amphiphile/enzyme de Langmuir à l'interface eau/air. A partir de nos résultats, une hypothèse sur l'évolution du film mixte amphiphile/ODA à l'interface air/eau a été proposée. Nous supposons qu'il existe une réorganisation des molécules d'enzyme avec les molécules de st arylamine pour des pressions de surface comprises entre 35 mN/m et 43 mN/m. Ce processus de réorganisation est contrôlé par le temps de relaxation du film. Cette hypothèse est confirmée par la spectroscopie FTIR-ATR et l'AFM du film LB mixte. Les micro biocapteurs potentiométriques (ENFETs) pour déterminer le trichlo fon ont été réalisés par cette méthode. Ce type de biocapteur a permis d'atteindre des limites de détection de 0.1μM. Nous avons aussi effectué deux types différents de membranes enzymatiques épaisses afin de réaliser des micro capteurs pour détecter le trichlo fon. Une procédure classique basée sur l'immobilisation de l'enzyme dans le BSA suivie de sa réticulation par le glutaraldéhyde est comparée à une nouvelle procédure par piégeage de l'enzyme en utilisant une matrice de polymère photo polymérisable : le PVA/SbQ contenant du styrylpyridinium. Sur la base de ces deux types d'ENFETs, les performances analytiques (la sensibilité, la durée de vie, la dynamique.) sont comparées à partir de l'inhibition de l'enzyme. Les résultats obtenus montrent que l'immobilisation d'enzyme dans la membrane PVA/SbQ conduit à des micro capteurs présentant de meilleures caractéristiques que celles qui sont obtenues par la réticulation de l'enzyme : une plus grande dynamique linéaire de mesure dans le mode cinétique, une meilleure reproductibilité et surtout une meilleure stabilité au stockage. Les deux types d'immobilisation conduisent à des micro capteurs qui présentent la même limite de détection pour le trichlo fon : 1μM.
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Cette thèse a pour objet principal la fonctionnalisation des surfaces de matériaux transducteurs électrochimiques et leur caractérisation en vue de l'obtention de capteurs chimiques et biochimiques. L’étude que nous avons menée concerne plus particulièrement l'élaboration de biocapteurs utilisant des enzymes comme biorécepteurs. Nous avons mis en œuvre de façon contrôlée les techniques de fonctionnalisation sur les divers substrats (platine silicium, carbone) et par création de liaisons covalentes entre les sites de surface et les molécules de reconnaissance; nous avons également élaboré des membranes enzymatiques épaisses pour la fonctionnalisation de certains transducteurs. Nous avons étudié la détection du glucose par mesure amperometrique en comparant l'efficacite des techniques d'immobilisation covalente sur les substrats platine et carbone. Les temps de réponse et les durées de vie obtenus montrent l'intérêt de ce type d'immobilisation pour la réalisation de biocapteurs enzymatiques. Nous avons ensuite procédé à la détection de glucose, urée, chlorure d'acétylcholine et le chlorure de butyrylcholine par des mesures conductimétriques sur ces microcapteurs à membrane épaisse. Ces capteurs permettent d'obtenir des limites de détection intéressantes et également de caractériser des systèmes enzymatiques de point de vue cinétique. Enfin, nous avons étudié la détection de pesticides organophosphorés par les systèmes conductimétriques et potentiométriques (ISFET). Une étude comparative a été menée, des limites de détection de 10-12 m pour le DFP et de 10-7 m pour le paraoxon-méthyl et le trichlorfon ont été obtenues
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Dans le domaine de l'environnement, il est très important de disposer d'outils capables de détecter la présence de polluants ou de substances toxiques au sein des milieux aqueux, tels que les écosystèmes aquatiques, l'eau des stations d'épuration, les effluents industriels. Les techniques classiques d’analyse pour la détection d’une espèce (bio) chimique sont généralement complexes, coûteux, volumineux et souvent difficiles à mettre en œuvre. De plus, les phases de préparation des échantillons et d’exploitation des résultats augmentent souvent très fortement la durée totale d’analyse. Depuis une trentaine d’années, ils font face à l’avènement des capteurs (bio)chimiques. Malgré une très forte demande et de nombreuses recherches effectuées, très peu de réalisations commerciales ont vu le jour, surtout dans le domaine de l’environnement. La difficulté majeure qui freine le développement industriel de ces capteurs est liée aux problèmes de sélectivité et de stabilité de l’élément sensible fixé sur la surface du transducteur au cours de l’étape de fonctionnalisation. Pour remédier à ces inconvénients, notre recherche est orientée vers la création de nouvelles matrices d’immobilisation de l’élément sensible et l’élaboration de nouveaux matériaux d’électrodes. Ce travail de thèse porte sur la réalisation et la caractérisation de capteurs chimiques et biochimiques basés sur l’utilisation de trois types de transduction. Le premier transducteur est conductimétrique avec des électrodes interdigitées : Le premier est un biocapteur bienzymatique à protéases immobilisées pour la détection de protéines en tant que marqueur de la matière organique ; Le deuxième est un biocapteur élaboré pour la détermination des nitrates en utilisant l’enzyme nitrate réductase (RN) de l’aspergillus niger immobilisé dans un film de PVC, en présence de Nafion® et de Méthyle viologen en tant que médiateur ; Le troisième est un capteur chimique pour détecter l’ammonium en immobilisant sur des électrodes interdigitées des membranes en PVC contenant la nonactine comme un élément de reconnaissance de l’ammonium ; Le deuxième type de transducteur est voltamétrique avec des électrodes en carbone vitreux pour la détermination de traces de mercure et de nickel. Le troisième type est un transducteur à fibre optique (chimiluminescence) pour la détection du cobalt immobilisé dans un film de chitosan ; le principe de ce capteur repose sur l’effet catalytique des ions métalliques comme le cobalt sur la réaction de chimiluminescence du luminol en présence de peroxyde d’hydrogène. Ces (bio)capteurs ont été validés sur des échantillons d’eau naturelle. Ils ont prouvé qu’ils constituent une technique d’analyse alternative performante, présentant des limites de détection très sensibles, de l’ordre du ng/l au μg/l, comparables à celles trouvées dans la littérature. Ils ont montré une rapidité de réponse de 5 à 7 minutes, une bonne sélectivité avec une bonne reproductibilité pour une longue durée de vie de un à trois mois. Enfin, ces techniques à faible coût, fonctionnant à température ambiante, sont prêtes à être utilisées sur le terrain. Ils permettent ainsi de réaliser des analyses de contrôle et de surveillance de milieux complexes sans traitement préalable des échantillons
Author: Nadia El Alami el Hassani Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 0
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Au cours des dernières décennies, les capteurs et les biocapteurs électrochimiques ont connu un développement considérable en raison de leur simplicité, fiabilité, rapidité et sélectivité. Ils ont constitué les alternatives les plus séduisantes pour les méthodes analytiques classiques dans des domaines aussi variés que l'agro-alimentaire, la médecine et la biologie clinique, ou le contrôle de la qualité de l'environnement. Dans ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés, dans un premier volet, aux développements des immunocapteurs et capteurs électrochimiques à base des polymères à empreintes moléculaires (MIPs) pour le contrôle de la qualité des miels. La première partie de ce volet concerne le développement des immunocapteurs sur des structures dites Bio-MEMS basées sur des microélectrodes en or. L'élaboration de ces immunocapteurs a été dédiée à la détection des résidus d'antibiotiques à savoir la sulfapyridine (SPy) et la tétracycline (TC). Une nouvelle structure des nanoparticules magnétiques (MNPs) revêtues du copolymère poly (acide pyrrole-co-pyrrole-2-carboxylique) a été exploitée dans ces travaux pour leur réseau d'immobilisation tridimensionnel ainsi que pour leur stabilité pendant de longues périodes. La détection de la SPy et de la TC a été réalisée par différentes approches compétitives en utilisant des anticorps polyclonaux. Dans la deuxième partie de ce volet, nous avons fabriqué des capteurs à base des MIPs pour la détection de la sulfaguanidine, la doxycycline et le chloramphénicol dans le miel. Ces dispositifs ont été développés sur la surface des électrodes sérigraphiées en or en employant une matrice polymérique du polyacrylamide en présence des molécules empreintes. Les performances de ces capteurs et biocapteurs (limite de détection, sélectivité, reproductibilité, application dans les milieux réels) ont ensuite été évaluées. Dans un deuxième volet, nous nous sommes parvenus à appliquer un dispositif de la langue électronique voltammétrique (Langue-EV) pour des analyses agroalimentaires et biomédicales. Dans un premier temps, nous avons discriminé les miels issus de quatorze régions de la France et du Maroc par le dispositif de la Langue-EV. Nous nous sommes aussi parvenus à démontrer la fiabilité de ce dispositif à prédire les résultats des différents paramètres physico-chimiques d'après les réponses des méthodes analytiques utilisées. Dans un deuxième temps, nous sommes passés à l'application du dispositif de la Langue-EV en analyse biomédicale dans le but de discriminer les urines des patientes souffrants des infections urinaires avec celles des femmes saines.
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Ce travail a pour objet la mise au point de (bio)capteurs utilisables dans des systèmes d'analyse en flux. L'AChE a été choisie comme bio récepteur biologique pour la mise au point des méthodes sensibles pour la détection des insecticides neurotoxiques. Deux axes principaux de recherche ont été suivis : (i) la mise au point des nouvelles méthodes d'immobilisation de l'AChE basées sur des liaisons de bioaffinité (ii) l'utilisation des enzymes provenant de différentes origines ou modifiées génétiquement pour améliorer la sensibilité et la sélectivité des analyses. Les biocapteurs développés dans cette thèse ont été mis au point et optimisés dans des systèmes appelés " batch " ou utilisés couplés avec les techniques d'analyse en flux. L'immobilisation par affinité de l'AChE d'une manière originale a été réalisée en utilisant la Con A (une lectine) qui peut se lier avec les sucres se trouvant à la surface de l'enzyme. Les deux méthodes proposées permettent l'immobilisation orientée de l'AChE, l'élimination des barrières de diffusion, la réutilisation des transducteurs...L'utilisation des enzymes provenant des organismes différents permet la construction de biocapteurs avec des performances améliorées. Ce travail a permis la mise au point de biocapteurs très sensibles pour la détection des insecticides carbamates grâce à l'utilisation de trois mutants de Dm. En plus, il a été proposé un système d'analyse en flux capable de faire la différence entre les inhibitions produites par des insecticides et d'autres composés. Au vu les résultats obtenus, nous pouvons envisager des applications potentielles études dans le domaine du monitorage de l'environnement.
Author: Alexandra Petreto Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 0
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La qualité de la prise en charge d'un patient repose sur la disponibilité d'outils diagnostiques performants. Le développement de biocapteurs s'appuyant sur le phénomène de transfert d'énergie par résonance de type Förster permet la détection de biomarqueurs spécifiques avec une grande précision et une bonne sensibilité. Le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) est un processus de transfert d'énergie dépendant de la distance fréquemment utilisé dans les applications de biodétection, dans lesquelles les reconnaissances, fonctions et structures biologiques sont de l'ordre de 1 à 20 nm. Cette thèse de doctorat présente la mise en œuvre de procédés de fabrication et de fonctionnalisation pour la détection optique de molécules d'intérêt biologique par FRET, en particulier pour des applications en diagnostic clinique et en séquençage d'ADN.Ce travail présente une étude du phénomène de FRET sur des surfaces d'aluminium fonctionnalisées, première étape du développement d'une plateforme de séquençage par FRET exalté par effet plasmonique. La détection quantitative du phénomène de FRET sur des surfaces d'aluminium fonctionnalisées par silanisation est développée, et les résultats de caractérisation de la fonctionnalisation par différentes méthodes (angle de contact, spectroscopie FTIR, imagerie de fluorescence) sont discutés en détails.Ce manuscrit expose également le développement d'un dispositif microfluidique fonctionnalisé pour la réalisation d'un immunodosage par FRET multiplexé. Dans l'optique de concevoir un dispositif intégré fonctionnalisé pour la détection par FRET en conditions microfluidiques, j'ai développé une stratégie pour la réalisation d'un biocapteur optique microfluidique par FRET multiplexé. Les résultats préliminaires de FRET entre deux anticorps fluorescents dans un canal microfluidique démontrent la faisabilité d'une telle plateforme de biodétection.
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Les biocapteurs sont des moyens d'analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,...). Dans ce type d'outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN...) doté d'un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d'analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement de différents biocapteurs, en se basant à l'immobilisation d'enzymes sur des microélectrodes en vue de la détection électrochimique d'analytes d'intérêt dans le domaine environnemental. Nous avons montré les potentialités d'application de deux biocapteurs conductimétrique et impédimétrique à base de lipase Candida Rugosa pour la détection directe et rapide des pesticides organophosphorés. Nous avons cherché à mieux comprendre le fonctionnement des biocapteurs et optimisé le procédé d'immobilisation des enzymes ainsi que différents paramètres de mesure afin de maximiser les performances analytiques des outils développés. Nous avons également élaboré un biocapteur impédimètrique pour une détermination très sensible de la phospholipase A2 en utilisant les nanoparticules d'or afin de renforcer la conductivité électrique. Enfin, nous avons développé un biocapteur de tyrosinase pour la détection du Bisphénol A, en se basant sur la modification électrochimique des électrodes de diamant dopé qui possèdent des propriétés électriques remarquables et uniques, avec l'ajout de nanotube de carbone multi-feuillet, ce qui permet d'améliorer des performances analytiques du biocapteur, en particulier sa limite de détection et sa stabilité. Les biocapteurs à base de lipase et de tyrosinase ont été appliqués avec succès à la quantification des composés organophosphorés et du bisphénol A respectivement dans plusieurs échantillons d'eaux réelles.
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Le but principal de ces travaux de thèse fut la conception et la réalisation de biocapteurs par utilisation de méthodes de transduction sans marquage, comme la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS), pour la détection de cible d'intérêts. Pour cela, différentes architectures moléculaires, spécifiques à la molécule d'intérêt ciblée, ont été développées afin de permettre la transduction du signal issu de la reconnaissance entre le biorécepteur et son substrat, et conduire ainsi à la détection de la cible.Les systèmes mis au point reposent sur l'intégration de nanomatériaux, tels que les nanotubes de carbones ou le disulfure de tungstène, pour assurer l'immobilisation de l'entité biospécifique à la surface du capteur. L'intérêt de ces matériaux est multiple puisqu'ils permettent une très forte augmentation de la surface spécifique du système et sont également mis à contribution lors de la fonctionnalisation de la surface de l'électrode. Un des grands défis rencontré dans le développement des biocapteurs étant la stratégie d'immobilisation de l'entité biospécifique sur la surface du capteur.Ces travaux se sont donc dans un premier temps intéressés à la réalisation et à la caractérisation de films minces de ces nanomatériaux ainsi qu'à leur transfert à la surface d'une électrode. Dans ce contexte, le but est de concevoir des bioarchitectures poreuses à base de polymères fonctionnels électrogénérés autour des nanostructures de carbone permettant la pénétration de grandes biomolécules comme des anticorps pour développer des immunocapteurs de haute performance.La seconde partie de ce travail s'est donc orientée vers la conception de biocapteurs par utilisation de ces différents matériaux. La fiabilité du procédé de la construction de ces nanostructures poreuses a été validée par la conception de systèmes immunologiques pour la détection de l'anticorps de l'antitoxine du choléra et l'anticorps de la toxine de la dengue.Enfin, un dernier biocapteur enzymatique, s'appuyant sur l'utilisation de nano-bâtonnets de disulfure de tungstène, a été développé. Ce dernier permet la détection de deux molécules d'intérêts, à savoir le catéchol et la dopamine, par utilisation de la polyphénol oxydase.
Author: Valérie Duplan Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 135
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Pendant que la menace potentielle du bioterrorisme augmente, il y a grand besoin d'un outil qui peut détecter les agents biologiques contaminants dans l'environnement de façon rapide, fiable et précise. Par contre, les méthodes traditionnelles utilisées nécessitent l'utilisation de laboratoires d'analyse sophistiquée, souvent dans des installations centralisées, ce qui demande un capital considérable et une main-d'oeuvre hautement qualifiée. Il est possible de développé des dispositifs basés sur les biocapteurs à faible coût et très efficace à la détection d'agents biologiques. De plus, ils peuvent être utilisés dans d'autres domaines, au jour le jour, tel pour la surveillance de contaminants dans les produits comestibles. Dans le but de résoudre ce problème, une nouvelle approche pour la fabrication d'un biocapteur optique a été développée. Celui-ci serait capable de détecter, de façon directe, des micro-organismes qui seraient immobilisés à sa surface plus rapidement et plus aisément qu'avec les méthodes conventionnelles. En effet, les expériences présentées visent la fabrication d'un biocapteur suite à la déposition de molécules biochimiques sur une hétérostructure de GaAs/ALGaAs. Le biocapteur ainsi produit tire parti de la photoluminescence émise par ce semi-conducteur quantique III-V pour la détection de microorganismes immobilisés spécifiquement et négativement chargés. La présente recherche est basée sur des techniques novatrices de biocapteurs pour lesquelles il existe peu de littérature. Les travaux expérimentaux et les explications théoriques se révèlent ainsi de nature très exploratoires. Les résultats préliminaires obtenus ont d'ailleurs été similaires aux prédictions initiales. De plus, les détails théoriques et explications physiques permettent de comprendre l'origine des résultats obtenus et d'établir, de manière convaincante, les procédures à suivre pour une architecture optimale. Je rapporte ainsi l'étude de la bio-fonctionnalisation du GaAs (001) visant l'immobilisation d'anticorps polyclonaux selon deux architectures différentes. De plus, les architectures proposées ont leurs régions actives ouvertes à l'environnement, pour permettre des mesures en continues et, en plus d'être des systèmes offrant la possibilité de multiplexage, offrent un potentiel de mesures en parallèle, pour un grand nombre de mesures en simultanées. Les résultats obtenus démontrent l'immobilisation réussie ainsi que la détection effectuée du virus de l' influenza A et des bactéries Escherichia coli et Legionella pneumophila respectivement. Enfin, les avantages et les limites de chaque architecture ont ensuite été détaillés.
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Cette étude porte sur la réalisation de biocapteurs et la mise au point d'un système d'analyse par injection en flux continu (FIA). Ces systèmes sont destinés au dosage de composés polluants présents dans l'eau, notamment de pesticides organophosphores et de carbamates. Ces biocapteurs associent une électrode de pH et une membrane enzymatique. Différentes techniques d'immobilisation des cholinesterases (acétylcholinestérase et butyrylcholinestérase) sur des membranes polyamide pré-activées, par piégeage dans un gel polymère et sur des membranes en toile de nylonTM sont d'abord présentées. Ensuite, l'optimisation des conditions opératoires et la comparaison de leurs performances sont examinées. Des capteurs enzymatiques à réponse rapide, pour le dosage de substrat, sont réalisés grâce à une nouvelle technique d'immobilisation d'enzyme sur électrode de verre (brevet français F-9011630, 1990). La nouveauté de cette technique réside dans le dépôt d'un agent réticulant vaporisé sur l'extrémité sensible de l'électrode de verre. Une simulation mathématique de la réponse de ces biocapteurs permet d'apprécier les quantités d'enzyme immobilisées. Un système FIA basé sur l'inhibition de l'acetylcholinestérase immobilisée au sein d'un réacteur tubulaire à rangée de billes, est mis au point pour le dosage des organophosphates et des carbamates. Plusieurs paramètres opératoires sont d'abord optimisés. Ce système est ensuite appliqué au dosage d'insecticides contaminant accidentellement l'eau de mer. La réactivation de l'enzyme inhibée dans le réacteur, permet sa réutilisation de nombreuses fois.
Author: Kai Wan
Author: Kai Wan
Author: André-Marie Nyamsi Hendji
Author: Basma Khadro
Author: Nadia El Alami el Hassani
Author: Bogdan Bucur
Author: Alexandra Petreto
Author: Nedjla Zehani
Author: Quentin Palomar
Author: Valérie Duplan
Author: Satish Kumaran