Développements d'outils de micro-échantillonnage par ablation laser et spectrométrie de masse pour la caractérisation de tissus biologiques PDF Download
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Author: Benoit Fatou Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 0
Book Description
L'émergence de nouvelles sources ambiantes d'ionisation rendent possible l'étude par spectrométrie de masse d'échantillons natifs, sans préparation nécessaire. En combinaison avec des méthodes d'échantillonnage, elles permettent l'identification de biomolécules en conservant leur localisation histologique. Dans ce contexte, nous avons développé deux outils de micro-échantillonnage pour la caractérisation de tissus biologiques. Le 1er est basé sur l'ablation laser par une source impulsionnelle à 532 nm suivie de la capture en goutte du matériel ablatée. Nous avons démontré que l'analyse de biomolécules capturées était possible malgré leur faible absorbance à cette longueur d'onde. Ceci est dû à l'existence d'un mécanisme d'ablation induit par le substrat qui se substitue au processus d'ablation directe entre le laser et l'échantillon irradié. Cette stratégie a été appliquée avec succès à l'étude de protéines et de lipides sur tissu. Le 2nd est un nouvel instrument d'analyse de biomolécules en temps réel. Basé sur l'ablation laser à 2,94 μm - en coïncidence avec une bande d'absorption intense de l'eau - et couplé au spectromètre de masse par un tube d'aspiration, il permet la caractérisation de tissus biologiques ex vivo et in vivo. Les profils moléculaires générés correspondent à des métabolites et des lipides. Le caractère faiblement invasif et indolore de l'irradiation laser a été démontré lors d'études in vivo sur des phalanges d'individus volontaires. Le potentiel de ce dispositif est finalement démontré par une application clinique, le cancer de l'ovaire et le développement de banques de données de profils moléculaires correspondant aux différents grades de la pathologie.
Author: Benoit Fatou Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 0
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L'émergence de nouvelles sources ambiantes d'ionisation rendent possible l'étude par spectrométrie de masse d'échantillons natifs, sans préparation nécessaire. En combinaison avec des méthodes d'échantillonnage, elles permettent l'identification de biomolécules en conservant leur localisation histologique. Dans ce contexte, nous avons développé deux outils de micro-échantillonnage pour la caractérisation de tissus biologiques. Le 1er est basé sur l'ablation laser par une source impulsionnelle à 532 nm suivie de la capture en goutte du matériel ablatée. Nous avons démontré que l'analyse de biomolécules capturées était possible malgré leur faible absorbance à cette longueur d'onde. Ceci est dû à l'existence d'un mécanisme d'ablation induit par le substrat qui se substitue au processus d'ablation directe entre le laser et l'échantillon irradié. Cette stratégie a été appliquée avec succès à l'étude de protéines et de lipides sur tissu. Le 2nd est un nouvel instrument d'analyse de biomolécules en temps réel. Basé sur l'ablation laser à 2,94 μm - en coïncidence avec une bande d'absorption intense de l'eau - et couplé au spectromètre de masse par un tube d'aspiration, il permet la caractérisation de tissus biologiques ex vivo et in vivo. Les profils moléculaires générés correspondent à des métabolites et des lipides. Le caractère faiblement invasif et indolore de l'irradiation laser a été démontré lors d'études in vivo sur des phalanges d'individus volontaires. Le potentiel de ce dispositif est finalement démontré par une application clinique, le cancer de l'ovaire et le développement de banques de données de profils moléculaires correspondant aux différents grades de la pathologie.
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La microanalyse de solides présente un intérêt croissant pour l'étude de composés d'intérêt astrophysique (agrégats de carbone, glaces cométaires) ou atmosphérique (molécules piégées dans les glaces, aérosols). Ce travail a porté sur la conception et la réalisation d'un système de microanalyse de solides base sur le couplage de l'ablation laser (LA), de la photoionisation résonante (REMPI) et de la spectrométrie de masse à temps de vol (TOF). Le principe de fonctionnement du dispositif, ses principales caractéristiques et ses performances sont présentés. Compte tenu du caractère émergent de ces recherches dans le laboratoire, les techniques nécessaires à la microanalyse (REMPI, LA) ont du être validées séparément. La technique REMPI a été testée sur le radical CH3 produit dans une flamme de méthane stabilisée sur un brûleur. Plusieurs profils de concentration obtenus dans différentes conditions de flammes ont été réalisés. La comparaison avec les techniques habituellement utilisées (impact électronique, spectromètre quadripolaire) a permis de démontrer la meilleure sensibilité de la détection REMPI/TOF et de la valider comme méthode d'analyse d'espèces minoritaires. L'échantillonnage par la sous vide a été mis en place sur le spectromètre et testé dans différentes configurations. Si la détection des ions produits lors du processus d'ablation s'est montrée insuffisante, l'ionisation non résonante des espèces neutres éjectées durant l'ablation s'est avérée nettement plus performante grâce aux grandes sensibilité et résolution qu'elle offre. Les premiers résultats expérimentaux portant sur les agrégats de carbone sont décrits. L'ensemble des techniques développées au cours de ce travail sont maintenant opérationnelles ce qui rend possible leur association en vue de l'objectif initial : la microanalyse de solides. La récente acquisition d'un laser à colorant permettra d'étendre les études en cours à l'analyse de processus hétérogènes de surface (aérosols carbones, glaces).
Author: Sarah Sanglier Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 248
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Ces dix dernières années, les développements de la spectrométrie de masse ont été spectaculaires et ont montré que cette technique était capable de transférer en phase gazeuse des complexes protéiques non-covalents sans les détruire. L'ionisation par électrospray permet à la fois d'introduire les échantillons en solution et de maintenir les interactions faibles préformées en solution en contrôlant soigneusement les conditions de fonctionnement de l'interface du spectromètre de masse. L'étude récente de ces complexes non-covalents par spectrométrie de masse est en plein essor : on parle de spectrométrie de masse supramoléculaire par opposition à la spectrométrie de masse moléculaire, où l'instrumentation est réglée de façon à rompre toutes les interactions non-covalentes.Ce travail a pour objectif d'élargir le champ d'applications de la spectrométrie de masse supramoléculaire en biologie. Il a porté principalement sur la mise au point de stratégies expérimentales permettant de répondre à divers problèmes biologiques, à savoir : d'une part, le développement d'une nouvelle approche basée sur la spectrométrie de masse supramoléculaire pour l'étude systématique d'interactions spécifiques entre une protéine et un ligand. Actuellement il est possible de produire un grand nombre de protéines, qui sont autant de cibles thérapeutiques potentielles, mais dont la fonction n'est pas toujours connue. Une nouvelle approche basée sur la spectrométrie de masse supramoléculaire a été mise au point pour identifier les ligands de protéines orphelines et ainsi accéder à leur fonction.d'autre part, la caractérisation par spectrométrie de masse ES de complexes non-covalents multiprotéiques de très hauts poids moléculaires, jusqu'à plusieurs millions de Daltons. Ces études préparent une spectrométrie de masse supramoléculaire capable d'analyser et de caractériser de gros complexes multiprotéiques et, par suite, d'accéder au complexome.
Author: David Bruneel Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 0
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Le développement actuel de la technologie induit une constante nécessité d'obtenir des tailles de plus en plus petites pouvant descendre jusqu'à des dimensions micrométriques et sub -micrométriques. L'ablation laser, qui a le grand avantage d'un enlèvement de matière très précis, est un candidat prometteur. Dans cette thèse on démontre la faisabilité de tirer avantage des impulsions laser femtosecondes avec la matière pour la micro et nano structuration, et ceci en ayant développé une machine compacte de grande précision et flexibilité. Une approche théorique comparant les régimes d'interaction à haute et basse cadence est présentée. Des investigations de l'efficacité du temps de procédé aussi bien que l'effet de la cadence pendant l'ablation de métaux ont été effectuées. Le potentiel de l'outil multifonctionnel couplé avec un oscillateur laser femtoseconde à haute cadence est montré pour différentes applications en biotechnologie. Les résultats sur la cartographie d'une large zone aussi bien que la nano découpe de précision de tissus biologiques et de matériaux variés sont présentés. Cet outil polyvalent couvre de larges domaines de recherche de la nano découpe d'échantillons biologiques aussi bien que la nanostructuration de différents types de matériaux. C'est d'un grand intérêt pour de nombreuses applications en science des matériaux, nanobiotechnologie et nanomédecine.
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L’ablation laser couplée à une détection par spectrométrie de masse à plasma induit apparait de plus en plus comme un outil de choix pour l’analyse des solides. L’utilisation de sources laser femtoseconde permet d’améliorer les performances analytiques du couplage, l’interaction laser-matière privilégiant les phénomènes athermiques contrairement aux lasers nanoseconde plus classiquement utilisés. Une collaboration entre le Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement de Pau et Novalase SA (spécialisé dans l’intégration optique et laser) a fait naitre la première station d’ablation laser femtoseconde intégrée. Ses caractéristiques particulières, que sont la haute cadence de tir et un optique de balayage rapide du faisceau, permettent d’explorer de nouvelles stratégies d’ablation et ouvrent des perspectives analytiques encourageantes en terme de sensibilité et de mode de quantification. Le potentiel de ce prototype a été évalué au travers d’analyses fondamentales, telles que le fractionnement élémentaire et l’étude de la taille des particules de l’aérosol produit par ablation, et de différentes applications telles que l’analyse de sols et de sédiments par dilution isotopique réalisée par le laser dans la chambre d’ablation, la détection de sélénoprotéines dans des gels d’électrophorèse et la détermination de l’isotopie de l’uranium dans des particules micrométriques.
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L'utilisation de lasers est largement répandue dans le domaine de la microanalyse directe des solides. La matière vaporisée, en focalisant un faisceau laser de forte puissance sur la cible, peut être analysée soit par spectrométrie d'émission optique sur plasma induit (LIBS, acronyme anglais pour Laser Induced Breakdown Spectroscopy), soit par une source à plasma induit par haute fréquence couplée à la spectrométrie d'émission optique (ICP-AES) ou à la spectrométrie de masse (ICP-MS). Avec une résolution spatiale à l'échelle microscopique, les techniques d'ablation laser permettent ainsi d'accéder à la composition élémentaire locale de la surface d'un matériau. Néanmoins, les performances analytiques de ces techniques pourraient être améliorées par l'utilisation combinée des informations LIBS et ICP afin également de comprendre et maîtriser davantage l'interaction laser/matière. Dans ce but, ce travail a consisté à développer une technique de microanalyse par ablation laser couplée avec une détection en simultané par ICP et par LIBS afin d'étudier les potentialités analytiques de cet instrument pour cartographier la surface des matériaux. Les performances et les limitations de ce système ont été évaluées d'une part, en caractérisant les aérosols produits par ablation laser et d'autre part, en étudiant les signaux LIBS et ICP obtenus à partir d'un même prélèvement de matière. Le phénomène de fractionnement élémentaire rencontré sur des matrices critiques telles que le laiton a été mis en évidence en microablation malgré des caractéristiques de l'interaction laser/matière différente de la macroablation. Une méthode de correction, a posteriori, par l'efficacité d'extraction de la cellule d'ablation a été proposée afin de pallier ces effets limitatifs pour l'analyse quantitative. Une cellule d'ablation, optimisée à partir d'une étude de simulation numérique, a été développée afin de s'adapter aux applications de cartographies de surface. Les performances analytiques du système ont été évaluées en termes de stabilité (8-10%), de résolution spatiale (5 μm) et de limites de détection (de l'ordre de la ppm dans le solide avec un détecteur de masse). La complémentarité des mesures LIBS et ICP représente à la fois un outil de diagnostic de l'interaction laser/matière et un instrument d'analyse très complet grâce à la double détection qui permet de suivre simultanément des traces et des majeurs sur une large gamme d'éléments de la classification périodique.
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CE TRAVAIL DE THESE MONTRE L'INTERET DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A DESORPTION/IONISATION LASER ASSISTEE PAR MATRICE (MALDI-TOF MS) COMME OUTIL D'ANALYSE STRUCTURALE DES PROTEINES. LE PRINCIPAL OBJECTIF DE CE TRAVAIL ETAIT D'AMELIORER LES PERFORMANCES DE CETTE TECHNIQUE D'IONISATION AFIN DE L'INTEGRER DANS LES STRATEGIES D'ANALYSE DU LABORATOIRE. LA PREMIERE PARTIE PRESENTE LE PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT D'UNE SOURCE MALDI ET D'UN ANALYSEUR A TEMPS DE VOL (TOF) AVEC UNE ATTENTION PARTICULIERE PORTEE SUR LES PARAMETRES CONDITIONNANT LA RESOLUTION ET LA QUALITE DES SPECTRES MALDI-TOF. LA PARTIE RESULTATS PRESENTE LE DEVELOPPEMENT D'APPROCHES ANALYTIQUES NOUVELLES BASEES SUR LA TECHNIQUE D'IONISATION MALDI ET LEUR APPLICATION A DES PROBLEMES DE BIOCHIMIE ANALYTIQUE DIFFICILES A RESOUDRE AVEC LES TECHNIQUES USUELLES TELS QUE (I) LA LOCALISATION RAPIDE DE SITES DE CLIVAGE PROTEOLYTIQUES D'ENZYMES PEU SPECIFIQUES (PROTEASES LEUCOCYTAIRES, CATHEPSINES) SUR DES PROTEINES MEMBRANAIRES (RECEPTEUR PLAQUETTAIRES, APP) (II) L'IDENTIFICATION PRECOCE DE MOLECULES INDUITES (PEPTIDES ANTIBACTERIENS D'INSECTES, HORMONE ANDROGENE DE CRUSTACE) DIRECTEMENT A PARTIR DU TISSUS OU DU FLUIDE DANS LEQUEL ELLES SONT PRODUITES OU VEHICULEES (III) LA VERIFICATION DE L'INTEGRITE DES MOLECULES (DIPTERICINE, HORMONE ANDROGENE) AU COURS DE LEUR PURIFICATION (IV) LA DETERMINATION DE L'HETEROGENEITE DE GLYCOSYLATION DE PROTEINES RECOMBINANTES (HLH, HFSH) (V) LA DETERMINATION DE LA STOECHIOMETRIE DE COMPLEXATION DE PROTEINES MULTIMERIQUES DE HAUT POIDS MOLECULAIRE (HEMOLYSINE, AEROLYSINE). LES DONNEES PRESENTEES DEMONTRENT QUE L'OBTENTION ET LA QUALITE DES RESULTATS PASSENT PAR LA MAITRISE DE L'ETAPE DE PREPARATION DE L'ECHANTILLON. UN MEILLEUR CONTROLE DES DIFFERENTS PARAMETRES DE COCRISTALLISATION DE L'ECHANTILLON AVEC LA MATRICE PERMET DES AMELIORATIONS SIGNIFICATIVES EN TERME DE SENSIBILITE, DE RESOLUTION ET DE PRECISION SUR LA MASSE.
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LES SPECTROMETRIES D'EMISSION ATOMIQUE ET DE MASSE ELEMENTAIRE UTILISANT UN PLASMA A COUPLAGE INDUCTIF (ICP-AES ET ICP-MS) SONT DESORMAIS DES TECHNIQUES BIEN ETABLIES POUR L'ANALYSE MULTIELEMENTAIRE DE TRACES DANS DIVERSES MATRICES NATURELLES OU SYNTHETIQUES. GENERALEMENT, L'INTRODUCTION DE L'ECHANTILLON DANS LE PLASMA SE FAIT PAR NEBULISATION PNEUMATIQUE D'UNE SOLUTION ISSUE D'UN TRAITEMENT CHIMIQUE (ATTAQUE) D'UNE MATRICE SOLIDE. CETTE ETAPE DE MISE EN SOLUTION PRESENTE DE NOMBREUSES LIMITATIONS ET EST RENDUE DE PLUS EN PLUS DIFFICILE PAR LA SOLUBILITE RESTREINTE ET LA RESISTANCE CHIMIQUE ELEVEE DE CERTAINS POLYMERES. L'ABLATION LASER, TERME QUI DECRIT LA DESTRUCTION PROGRESSIVE ET SUPERFICIELLE D'UNE CIBLE SOLIDE, EST UNE TECHNIQUE D'INTRODUCTION DE L'ECHANTILLON TRES ATTRACTIVE. OUTRE L'ELIMINATION DE TOUTE PREPARATION CHIMIQUE, ET DONC LE GAIN EN TEMPS D'ANALYSE QU'ELLE OFFRE, CETTE METHODE D'ECHANTILLONNAGE DISPOSE D'UNE RESOLUTION SPATIALE DONNANT ACCES A DES INFORMATIONS NOUVELLES QUANT A LA REPARTITION DES ELEMENTS DANS UNE MATRICE. CEPENDANT, LES PARAMETRES REGISSANT L'INTERACTION LASER-MATIERE SONT ENCORE MAL MAITRISES, ET LES ETUDES CONCERNANT L'ANALYSE DES MATIERES PLASTIQUES PAR ABLATION LASER-PLASMA ICP SONT QUASIMENT INEXISTANTES. L'OBJECTIF DE CE TRAVAIL RESIDE DANS LE DEVELOPPEMENT ET L'EVALUATION ANALYTIQUE DE CE COUPLAGE POUR L'ANALYSE ELEMENTAIRE IN SITU DES ADDITIFS DES MATIERES PLASTIQUES. LES PERFORMANCES DE L'ETAPE D'ECHANTILLONNAGE, DONT L'ELEMENT FONDAMENTAL EST LE FAISCEAU LASER ET SES PROPRIETES, ONT ETE ETUDIEES AFIN D'APPROFONDIR NOS CONNAISSANCES DU MECANISME D'INTERACTION LASER-POLYMERE. L'INFLUENCE DE PARAMETRES TELS QUE LA LONGUEUR D'ONDE, L'ENERGIE D'IRRADIATION OU LA FOCALISATION DU FAISCEAU LASER A ETE EVALUEE. LES CONTRIBUTIONS DES EFFETS DE SEUIL D'ABLATION DES POLYMERES ET DES EFFETS D'ECRAN CREES PAR LE MICROPLASMA INDUIT PAR LASER SONT DISCUTEES. L'ETUDE DE L'INFLUENCE DES PROPRIETES DES ECHANTILLONS A REVELE L'IMPORTANCE DE PARAMETRES NOUVEAUX TELS QUE LA STRUCTURE CHIMIQUE DES ADDITIFS DES POLYMERES, OU LES INTERACTIONS ENTRE ADDITIFS ET POLYMERES. L'EVALUATION ANALYTIQUE DU COUPLAGE A MIS EN EXERGUE D'EXCELLENTES PERFORMANCES EN TERMES DE REPRODUCTIBILITE (2-5%), DE LINEARITE DE L'ETALONNAGE, ET DE LIMITES DE DETECTION (INFERIEURES A LA PPB). CES RESULTATS PLACENT CETTE TECHNIQUE A UN RANG DE PERFORMANCE AU MOINS EQUIVALENT A CELUI DE LA FLUORESCENCE X OU DE L'ACTIVATION NEUTRONIQUE POUR L'ANALYSE DES SOLIDES.
Author: Benoit Fatou
Author: Benoit Fatou
Author: Jean-Yves Gadat
Author: Jean-Luc DAUTHERIBES
Author: Sarah Sanglier
Author: 
Author: David Bruneel
Author: Fanny Claverie
Author: Flory-Anne Barreda
Author: MARC.. MONIATTE
Author: MICHEL.. HEMMERLIN