Développement de la spectrométrie de masse pour l'étude d'édifices non-covalents en chimie et en biologie PDF Download
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Author: Aurélie Même Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 197
Book Description
Compte tenu de l’omniprésence des interactions non-covalentes en chimie et en biologie, leur étude est devenue incontournable. Les techniques analytiques les plus fréquemment utilisées comme la RMN et la cristallographie RX sont difficiles voire impossibles à mettre en œuvre pour l’analyse de certains édifices non-covalents. De nouveaux outils analytiques sont par conséquent nécessaires pour résoudre ces problématiques. Lors de ce travail de thèse, nous avons donc évalué le potentiel de la spectrométrie de masse et notamment de deux techniques d’ionisation douce : l’ionisation électrospray (ESI-MS) et l’Ionisation/Désorption Laser Assistée par Matrice (MALDI-MS). Ce travail s’est articulé selon trois axes : i) l’analyse d’édifices neutres, insolubles ou solubles dans des solvants très volatils comme le dichlorométhane ou le chloroforme : ces analytes offrent l’opportunité de tester une approche par MALDI-MS comme alternative à l’ESI-MS, ii) l’étude in vivo et in vitro d’une petite molécule à visée thérapeutique, le myo-Inositol trispyrophosphate (ITPP), dans le sang : cette étude doit permettre de mieux comprendre le mécanisme de régulation de l’ITPP, iii) l’étude du complexe Adx/AdR, impliqué dans la biosynthèse des stéroïdes chez les vertébrés : la mesure des constantes de stabilité des complexes formés à partir de variants d’Adx doit permettre de mieux comprendre le mécanisme d’interaction entre ces deux partenaires redox lors du transfert d’électron.
Author: Aurélie Même Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 197
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Compte tenu de l’omniprésence des interactions non-covalentes en chimie et en biologie, leur étude est devenue incontournable. Les techniques analytiques les plus fréquemment utilisées comme la RMN et la cristallographie RX sont difficiles voire impossibles à mettre en œuvre pour l’analyse de certains édifices non-covalents. De nouveaux outils analytiques sont par conséquent nécessaires pour résoudre ces problématiques. Lors de ce travail de thèse, nous avons donc évalué le potentiel de la spectrométrie de masse et notamment de deux techniques d’ionisation douce : l’ionisation électrospray (ESI-MS) et l’Ionisation/Désorption Laser Assistée par Matrice (MALDI-MS). Ce travail s’est articulé selon trois axes : i) l’analyse d’édifices neutres, insolubles ou solubles dans des solvants très volatils comme le dichlorométhane ou le chloroforme : ces analytes offrent l’opportunité de tester une approche par MALDI-MS comme alternative à l’ESI-MS, ii) l’étude in vivo et in vitro d’une petite molécule à visée thérapeutique, le myo-Inositol trispyrophosphate (ITPP), dans le sang : cette étude doit permettre de mieux comprendre le mécanisme de régulation de l’ITPP, iii) l’étude du complexe Adx/AdR, impliqué dans la biosynthèse des stéroïdes chez les vertébrés : la mesure des constantes de stabilité des complexes formés à partir de variants d’Adx doit permettre de mieux comprendre le mécanisme d’interaction entre ces deux partenaires redox lors du transfert d’électron.
Author: Sarah Sanglier Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 248
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Ces dix dernières années, les développements de la spectrométrie de masse ont été spectaculaires et ont montré que cette technique était capable de transférer en phase gazeuse des complexes protéiques non-covalents sans les détruire. L'ionisation par électrospray permet à la fois d'introduire les échantillons en solution et de maintenir les interactions faibles préformées en solution en contrôlant soigneusement les conditions de fonctionnement de l'interface du spectromètre de masse. L'étude récente de ces complexes non-covalents par spectrométrie de masse est en plein essor : on parle de spectrométrie de masse supramoléculaire par opposition à la spectrométrie de masse moléculaire, où l'instrumentation est réglée de façon à rompre toutes les interactions non-covalentes.Ce travail a pour objectif d'élargir le champ d'applications de la spectrométrie de masse supramoléculaire en biologie. Il a porté principalement sur la mise au point de stratégies expérimentales permettant de répondre à divers problèmes biologiques, à savoir : d'une part, le développement d'une nouvelle approche basée sur la spectrométrie de masse supramoléculaire pour l'étude systématique d'interactions spécifiques entre une protéine et un ligand. Actuellement il est possible de produire un grand nombre de protéines, qui sont autant de cibles thérapeutiques potentielles, mais dont la fonction n'est pas toujours connue. Une nouvelle approche basée sur la spectrométrie de masse supramoléculaire a été mise au point pour identifier les ligands de protéines orphelines et ainsi accéder à leur fonction.d'autre part, la caractérisation par spectrométrie de masse ES de complexes non-covalents multiprotéiques de très hauts poids moléculaires, jusqu'à plusieurs millions de Daltons. Ces études préparent une spectrométrie de masse supramoléculaire capable d'analyser et de caractériser de gros complexes multiprotéiques et, par suite, d'accéder au complexome.
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Le spectromètre de masse hybride en tandem le LTQ-Orbitrap, dans lequel les ions sont détectés avec une grande précision en masse, a été utilisé dans les deux stratégies différentes de la métabolomique, c'est-à-dire l’approche globale et ciblée. Dans l’approche dite ciblée, il s’agit de mesurer la concentration de métabolites connus ou révélés par la transcriptomique ou la protéomique. Mais dès lors le problème majeur est la quantification absolue de ces métabolites, qui est généralement faite en LC/MS/MS en mode MRM (multiple réaction monitoring) dans les instruments hybrides de type spatiaux (exemple : triple quadripôle). Ce mode de balayage repose sur le suivi d’une voie de fragmentation du métabolite d’intérêt. La LC/FTMS ne nécessite pas de ciblé son analyse sur un seul ion précurseur. Elle permet le balayage sur toute une gamme de masse (de m/z), on propose ainsi une méthode de détection globale des masses basée sur la technologie Orbitrap . Dans l’approche globale, il s’agit de déterminer les flux métabolomiques dans un tissu ou fluide biologique en fonction de son environnement afin de déterminer des biomarqueurs. Bien que guidée par les statistiques, l’analyse de ces échantillons est complexe, aux vus du nombre de signaux détectés. La FTMS (Spectrométrie de Masse à Transformée de Fourrier), couplée généralement à la chromatographie liquide, permet d’avoir une unique composition élémentaire pour les métabolites de faibles masses moléculaires (inférieures à 500 u) permettant ainsi de faciliter l’identification des métabolites. Une alternative attrayante est l’injection directe automatisée (FIA) de l’échantillon complexe, mais elle entraine une perte d’information. Le but de ma thèse a été dès lors d’optimiser le traitement des données issu de FIA-FTMS et de quantifier la perte d’information inhérente à cette approche. Enfin, on utilise ce spectromètre pour l’étude de complexe non-covalent visant à caractériser l’interaction de complexes peptide-peptide et ADN-peptide. On observe une interaction non covalente très forte entre les résidus arginine et les groupements phosphate. Cette thèse montre le rôle joué par les formes zwitterioniques dans la stabilisation de tels complexes. Les mécanismes, expliquant les différentes voies de fragmentations, sont proposés et impliquent la formation de pont salin entre les espèces expliquant sa grande stabilité en phase gazeuse
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L'élucidation des interactions non-covalentes des complexes biologiques revêt d'une importance majeure dans la compréhension du fonctionnement cellulaire. L'objectif de ce travail de thèse est d'approfondir les développements de la spectrométrie de masse (MS) pour l'étude de ces complexes, que ce soit par MALDI-MS (la désorption-ionisation laser assistée par matrice) ou par ESI-MS (l'ionisation électrospray). Ce travail s'est articulé autour de trois axes : i) étude de la stœchiométrie et de la topologie du complexe SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acétyltransferase, module Histone Acétyl Transferase) par pontage chimique couplé à la MS ; ii) suivi de la dimérisation des complexes formés par RAR-RXR (récepteur de l'acide rétinoïque - récepteur X des rétinoïdes) avec différents ADNs ; iii) mesure de la constante de dissociation des complexes RXR-ligand. Les méthodologies développées ont permis de repousser le potentiel de la MS et d'obtenir des informations structurales des complexes biologiques.
Author: BOUCHONNET Stéphane Publisher: Lavoisier ISBN: 2743064528 Category : Chemical structure Languages : en Pages : 218
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C’est avec une réelle volonté didactique que cet ouvrage aborde l’interprétation des spectres de masse pour confirmer ou élucider des structures chimiques. Les publications scientifiques dédiées à la spectrométrie de masse sont souvent complexes et présentent une approche très théorique, souvent difficile à comprendre et à mettre en pratique. Ce livre se fait fort, grâce à sa simplicité et à sa démarche ancrée dans la pratique, d’offrir aux débutants comme aux spécialistes du domaine, les clés de cette technique. Un premier chapitre présente des rappels de chimie organique nécessaires à une bonne compréhension des réactions impliquées. Dans un deuxième chapitre, les mécanismes de formation et de dissociation des ions sont détaillés : ruptures simples et réarrangements, fragmentations secondaires, etc. Ces mécanismes sont illustrés de nombreux exemples concrets. La seconde partie de cet ouvrage propose une cinquantaine d'exercices corrigés permettant d'acquérir maîtrise et autonomie. À la fois manuel universitaire et guide pratique quotidien, L’interprétation des spectres de masse en couplage GC-MS constitue une référence pour tous les utilisateurs de couplage GC-MS tels que les ingénieurs, techniciens, chercheurs, étudiants, etc., débutants ou confirmés, désireux d'interpréter judicieusement leurs spectres de masse. Outre l'élucidation structurale, la compréhension des mécanismes qui régissent l'interprétation des spectres permet l'amélioration des méthodes analytiques et la fiabilisation des résultats.
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Premier ouvrage spécifiquement consacré à ce couplage, La spectrométrie de masse en couplage avec la chromatographie en phase gazeuse se différencie des autres publications scientifiques dédiées à la spectrométrie de masse en abordant la technologie avec une réelle volonté didactique. Ce manuel propose une démarche ancrée dans la pratique et offre des atouts décisifs pour gagner en temps et en qualité : une approche simple et précise du principe de fonctionnement des spectromètres de masse utilisés en couplage GC-MS, avec un minimum d'équations mathématiques, un comparatif des différents types de sources, d'analyseurs et de détecteurs, une mise en avant des aspects pratiques tels que la stratégie de mise au point d'une méthode de dosage ou l'utilisation d'une bibliothèque de spectres, un inventaire des problèmes et des "pièges" habituellement rencontrés par les utilisateurs de couplage GC-MS, un recueil des erreurs les plus communément commises et les solutions claires pour s'en affranchir. Ces conseils sont illustrés par de nombreux exemples choisis dans des domaines aussi divers que la toxicologie ou l'analyse environnementale avec toujours un double objectif pour les utilisateurs : leur permettre de tirer rapidement le meilleur parti de leur spectromètre de masse, les assister dans la détermination du matériel et des méthodes les plus appropriés à un contexte analytique donné (identification structurale, dosages multi-résidus, détermination de composés à l'état de traces en matrices complexes, etc.).
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La microanalyse de solides présente un intérêt croissant pour l'étude de composés d'intérêt astrophysique (agrégats de carbone, glaces cométaires) ou atmosphérique (molécules piégées dans les glaces, aérosols). Ce travail a porté sur la conception et la réalisation d'un système de microanalyse de solides base sur le couplage de l'ablation laser (LA), de la photoionisation résonante (REMPI) et de la spectrométrie de masse à temps de vol (TOF). Le principe de fonctionnement du dispositif, ses principales caractéristiques et ses performances sont présentés. Compte tenu du caractère émergent de ces recherches dans le laboratoire, les techniques nécessaires à la microanalyse (REMPI, LA) ont du être validées séparément. La technique REMPI a été testée sur le radical CH3 produit dans une flamme de méthane stabilisée sur un brûleur. Plusieurs profils de concentration obtenus dans différentes conditions de flammes ont été réalisés. La comparaison avec les techniques habituellement utilisées (impact électronique, spectromètre quadripolaire) a permis de démontrer la meilleure sensibilité de la détection REMPI/TOF et de la valider comme méthode d'analyse d'espèces minoritaires. L'échantillonnage par la sous vide a été mis en place sur le spectromètre et testé dans différentes configurations. Si la détection des ions produits lors du processus d'ablation s'est montrée insuffisante, l'ionisation non résonante des espèces neutres éjectées durant l'ablation s'est avérée nettement plus performante grâce aux grandes sensibilité et résolution qu'elle offre. Les premiers résultats expérimentaux portant sur les agrégats de carbone sont décrits. L'ensemble des techniques développées au cours de ce travail sont maintenant opérationnelles ce qui rend possible leur association en vue de l'objectif initial : la microanalyse de solides. La récente acquisition d'un laser à colorant permettra d'étendre les études en cours à l'analyse de processus hétérogènes de surface (aérosols carbones, glaces).
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Parmi l’ensemble des techniques spectroscopiques, la spectrométrie de masse s’est imposée au fil des années comme une méthode analytique incontournable tant au niveau de discipline comme la chimie, la pharmacologie, la géologie, l’environnement, la biologie/biochimie, la médecine ou les sciences médico-légales... Cet outil a la capacité de séparer, de mesurer, de quantifier et d’obtenir de l’information structurale de particules subatomiques, d’atomes, de groupes d’atomes, de molécules, de macromolécules et maintenant d’agrégats moléculaires. Après un bref historique consacré à identifier les travaux de recherche du siècle dernier qui ont conduit à la naissance de la spectrométrie de masse, ce mémoire présente une vision pédagogique nouvelle de l’enseignement de la spectrométrie de masse auprès d’étudiants (non physiciens) en biologie/biochimie, en médecine, en chimie... La spectrométrie de masse de type matrix-assisted laser/desorption ionization (MALDI)-time-of-flight (TOF) est plus particulièrement développée et est illustrée par la présentation de travaux relatifs à : (i) la caractérisation structurale de modifications post-traductionnelles comme la glycosylation, (ii) l’approche protéomique des cellules endothéliales de capillaires cérébraux au phénotype barrière hémato-encéphalique et (iii) le profilage en masse de milieu biologique ou de bactéries. De par ses atouts, la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF jouera sans nul doute dans les prochaines années un rôle prépondérant pour le management de la qualité et de la sécurité alimentaires. Les méthodes et les concepts restent cependant à inviter et à d’adapter au domaine agro-alimentaire. We are what we eat !
Author: Aurélie Même
Author: Aurélie Même
Author: Sarah Sanglier
Author: Ludovic Muller
Author: Nha Thi Nguyen Huynh
Author: BOUCHONNET Stéphane
Author: BOUCHONNET Stéphane
Author: Rusconi, Filippo
Author: Jean-Yves Gadat
Author: Christophe Flahaut
Author: Jean Claude Lorquet