CARACTERISATION STRUCTURALE DE BIOMOLECULES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE A DESORPTION/IONISATION LASER ASSISTEE PAR MATRICE PDF Download
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CE TRAVAIL DE THESE MONTRE L'INTERET DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A DESORPTION/IONISATION LASER ASSISTEE PAR MATRICE (MALDI-TOF MS) COMME OUTIL D'ANALYSE STRUCTURALE DES PROTEINES. LE PRINCIPAL OBJECTIF DE CE TRAVAIL ETAIT D'AMELIORER LES PERFORMANCES DE CETTE TECHNIQUE D'IONISATION AFIN DE L'INTEGRER DANS LES STRATEGIES D'ANALYSE DU LABORATOIRE. LA PREMIERE PARTIE PRESENTE LE PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT D'UNE SOURCE MALDI ET D'UN ANALYSEUR A TEMPS DE VOL (TOF) AVEC UNE ATTENTION PARTICULIERE PORTEE SUR LES PARAMETRES CONDITIONNANT LA RESOLUTION ET LA QUALITE DES SPECTRES MALDI-TOF. LA PARTIE RESULTATS PRESENTE LE DEVELOPPEMENT D'APPROCHES ANALYTIQUES NOUVELLES BASEES SUR LA TECHNIQUE D'IONISATION MALDI ET LEUR APPLICATION A DES PROBLEMES DE BIOCHIMIE ANALYTIQUE DIFFICILES A RESOUDRE AVEC LES TECHNIQUES USUELLES TELS QUE (I) LA LOCALISATION RAPIDE DE SITES DE CLIVAGE PROTEOLYTIQUES D'ENZYMES PEU SPECIFIQUES (PROTEASES LEUCOCYTAIRES, CATHEPSINES) SUR DES PROTEINES MEMBRANAIRES (RECEPTEUR PLAQUETTAIRES, APP) (II) L'IDENTIFICATION PRECOCE DE MOLECULES INDUITES (PEPTIDES ANTIBACTERIENS D'INSECTES, HORMONE ANDROGENE DE CRUSTACE) DIRECTEMENT A PARTIR DU TISSUS OU DU FLUIDE DANS LEQUEL ELLES SONT PRODUITES OU VEHICULEES (III) LA VERIFICATION DE L'INTEGRITE DES MOLECULES (DIPTERICINE, HORMONE ANDROGENE) AU COURS DE LEUR PURIFICATION (IV) LA DETERMINATION DE L'HETEROGENEITE DE GLYCOSYLATION DE PROTEINES RECOMBINANTES (HLH, HFSH) (V) LA DETERMINATION DE LA STOECHIOMETRIE DE COMPLEXATION DE PROTEINES MULTIMERIQUES DE HAUT POIDS MOLECULAIRE (HEMOLYSINE, AEROLYSINE). LES DONNEES PRESENTEES DEMONTRENT QUE L'OBTENTION ET LA QUALITE DES RESULTATS PASSENT PAR LA MAITRISE DE L'ETAPE DE PREPARATION DE L'ECHANTILLON. UN MEILLEUR CONTROLE DES DIFFERENTS PARAMETRES DE COCRISTALLISATION DE L'ECHANTILLON AVEC LA MATRICE PERMET DES AMELIORATIONS SIGNIFICATIVES EN TERME DE SENSIBILITE, DE RESOLUTION ET DE PRECISION SUR LA MASSE.
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CE TRAVAIL DE THESE MONTRE L'INTERET DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A DESORPTION/IONISATION LASER ASSISTEE PAR MATRICE (MALDI-TOF MS) COMME OUTIL D'ANALYSE STRUCTURALE DES PROTEINES. LE PRINCIPAL OBJECTIF DE CE TRAVAIL ETAIT D'AMELIORER LES PERFORMANCES DE CETTE TECHNIQUE D'IONISATION AFIN DE L'INTEGRER DANS LES STRATEGIES D'ANALYSE DU LABORATOIRE. LA PREMIERE PARTIE PRESENTE LE PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT D'UNE SOURCE MALDI ET D'UN ANALYSEUR A TEMPS DE VOL (TOF) AVEC UNE ATTENTION PARTICULIERE PORTEE SUR LES PARAMETRES CONDITIONNANT LA RESOLUTION ET LA QUALITE DES SPECTRES MALDI-TOF. LA PARTIE RESULTATS PRESENTE LE DEVELOPPEMENT D'APPROCHES ANALYTIQUES NOUVELLES BASEES SUR LA TECHNIQUE D'IONISATION MALDI ET LEUR APPLICATION A DES PROBLEMES DE BIOCHIMIE ANALYTIQUE DIFFICILES A RESOUDRE AVEC LES TECHNIQUES USUELLES TELS QUE (I) LA LOCALISATION RAPIDE DE SITES DE CLIVAGE PROTEOLYTIQUES D'ENZYMES PEU SPECIFIQUES (PROTEASES LEUCOCYTAIRES, CATHEPSINES) SUR DES PROTEINES MEMBRANAIRES (RECEPTEUR PLAQUETTAIRES, APP) (II) L'IDENTIFICATION PRECOCE DE MOLECULES INDUITES (PEPTIDES ANTIBACTERIENS D'INSECTES, HORMONE ANDROGENE DE CRUSTACE) DIRECTEMENT A PARTIR DU TISSUS OU DU FLUIDE DANS LEQUEL ELLES SONT PRODUITES OU VEHICULEES (III) LA VERIFICATION DE L'INTEGRITE DES MOLECULES (DIPTERICINE, HORMONE ANDROGENE) AU COURS DE LEUR PURIFICATION (IV) LA DETERMINATION DE L'HETEROGENEITE DE GLYCOSYLATION DE PROTEINES RECOMBINANTES (HLH, HFSH) (V) LA DETERMINATION DE LA STOECHIOMETRIE DE COMPLEXATION DE PROTEINES MULTIMERIQUES DE HAUT POIDS MOLECULAIRE (HEMOLYSINE, AEROLYSINE). LES DONNEES PRESENTEES DEMONTRENT QUE L'OBTENTION ET LA QUALITE DES RESULTATS PASSENT PAR LA MAITRISE DE L'ETAPE DE PREPARATION DE L'ECHANTILLON. UN MEILLEUR CONTROLE DES DIFFERENTS PARAMETRES DE COCRISTALLISATION DE L'ECHANTILLON AVEC LA MATRICE PERMET DES AMELIORATIONS SIGNIFICATIVES EN TERME DE SENSIBILITE, DE RESOLUTION ET DE PRECISION SUR LA MASSE.
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE EST AUJOURD'HUI DEVENUE UNE TECHNIQUE INCONTOURNABLE POUR LA RECHERCHE EN BIOCHIMIE. ELLE A CONNU CES DIX DERNIERES ANNEES, UN ESSOR CONSIDERABLE DANS LA CARACTERISATION DES BIOMOLECULES ET EN PARTICULIER DANS L'ANALYSE DES PEPTIDES ET DES PROTEINES. CE TRAVAIL DE THESE A ETE ORIENTE SIMULTANEMENT DANS DEUX DIRECTIONS. NOUS AVONS D'UNE PART PROGRESSE DANS L'UTILISATION DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR OBTENIR DES DONNEES STRUCTURALES, PRINCIPALEMENT EN FOCALISANT SUR L'AMELIORATION DE LA METHODE POUR ATTEINDRE LE DOMAINE SUB-PICOMOLAIRE. NOUS AVONS AMELIORE : - LA SENSIBILITE EN NANOES-MS A L'AIDE D'UN BANC D'ESSAI PERMETTANT L'EVALUATION DU CAPILLAIRE. - LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE EN MALDI-MS GRACE A UNE PREPARATION DE L'ECHANTILLON ADAPTEE. NOUS AVONS D'AUTRE PART, RELEVE LE DEFI QUI CONSISTAIT A RESOUDRE DES PROBLEMES DE CARACTERISATION POSES PAR LES BIOCHIMISTES AUX SPECTROMETRISTES DE MASSE, APRES EPUISEMENT DE TOUTES LES AUTRES POSSIBILITES DES ANALYSES CLASSIQUES (RMN, DEGRADATION D'EDMAN, COMPOSITION EN ACIDES AMINES, GEL D'ELECTROPHORESE). GRACE AU GAIN DE SENSIBILITE ET A L'AMELIORATION DE LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE, NOUS AVONS PU ABORDE L'ETUDE DE PROBLEMES BIOLOGIQUES REELS ET AINSI CARACTERISER : - LA PREMIERE TOXINE DE SCORPION GLYCOSYLEE, - UN PEPTIDE ANTIBACTERIEN DE CREVETTE PANAEUS VANNAMEI, - UNE NOUVELLE MODIFICATION POST-TRADUCTIONNELLE DE LA SCHISTOSOMA MANSONI P28. NOUS AVONS D'AUTRE PART : - IDENTIFIE LA KININOGENE HUMAINE, PROTEINE RESPONSABLE DE L'IMMUNOGENICITE DE LOTS DE FACTEUR VIII. CETTE ETUDE S'INSCRIT DANS LE CADRE GENERAL DU PROJET PROTEOME, - LOCALISE UN PEPTIDE MODIFIE CHIMIQUEMENT PAR PHOTOMARQUAGE LORS DE L'ETUDE DES SITES DE LIAISON DE LA BUCHE, - DETERMINE DES SITES SPECIFIQUES D'HYDROLYSE DE LA GPV ET DE RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (PAR 1, PAR 2).
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Ces 10 dernières années ont vu une évolution rapide de la spectrométrie de masse en fonction des besoins croissant des biologistes, dès l'avènement des nouvelles techniques d'ionisation dite douces que sont le MALDI (Désorption Ionisation laser assisté par matrice) et l'ESI (ionisation electrospray) permettant enfin la détection intacte de molécules d'origine biologique.Ce travail de thèse a porté principalement sur le choix et la mise au point de la stratégie instrumentale et analytique pour mener à bien quatre collaborations, soient quatre problèmes montrant à la fois la diversité des approches et la multiplicité des solutions apportées par la spectrométrie de masse. Le premier sujet a porté sur l'isolement de peptides biologiquement actifs dans l'hémolymphe de drosophiles immunisées. Nous avons réalisé le séquençage de novo par spectrométrie de masse de l'un de ces peptides bloqué en N-terminal, appelé DIM 13 (Drosophila Immune Induced molecule 13). Le second sujet a porté sur l'étude de la conformité structurale d'une enzyme, la dipeptidyl-diamino-peptidase. Nous avons pu établir la conformité de la protéine recombinante par rapport à la protéine naturelle et donné la description détaillée de ses modifications post-traductionnnelles.Le troisième sujet a consisté à l'établissement du protéome de la rétine de souris. Une première approche a conduit à l'identification d'une centaine de protéines de la rétine. Puis dans une seconde approche une étude différentielle a été entreprise comparant les protéines observées sur gel SDS PAGE 2D obtenu à partir de rétines de souris normales versus les protéines obtenues à partir de rétines de souris rd1 (retinal degenerescence 1). Enfin la dernière étude a porté sur la description de la composition en protéines d'un complexe de facteur de transcription, le complexe TFTC. Notre approche a permis d'ajouter 2 nouvelles protéines à la liste des protéine déjà identifiées par des méthodes de biochimie classique.
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L'élucidation des interactions non-covalentes des complexes biologiques revêt d'une importance majeure dans la compréhension du fonctionnement cellulaire. L'objectif de ce travail de thèse est d'approfondir les développements de la spectrométrie de masse (MS) pour l'étude de ces complexes, que ce soit par MALDI-MS (la désorption-ionisation laser assistée par matrice) ou par ESI-MS (l'ionisation électrospray). Ce travail s'est articulé autour de trois axes : i) étude de la stœchiométrie et de la topologie du complexe SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acétyltransferase, module Histone Acétyl Transferase) par pontage chimique couplé à la MS ; ii) suivi de la dimérisation des complexes formés par RAR-RXR (récepteur de l'acide rétinoïque - récepteur X des rétinoïdes) avec différents ADNs ; iii) mesure de la constante de dissociation des complexes RXR-ligand. Les méthodologies développées ont permis de repousser le potentiel de la MS et d'obtenir des informations structurales des complexes biologiques.
Author: Ana Paula Moraes Ventura Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 552
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Grâce au séquençage des génomes et aux progrès de la spectrométrie de masse, l'analyse protéomique se révèle un outil puissant pour l'identification des protéines. Les techniques telles que l'électrophorèse bidimensionnelle, la spectrométrie de masse et la bioinformatique constituent les clés d'une approche nommée " méthodologie classique de la protéomique ". La recherche en protéomique évolue de plus en plus vers la caractérisation de protéines issues de mélanges complexes, avec pour but de mieux comprendre les systèmes biologiques, les interactions entre protéines, ainsi que leurs fonctions. Deux méthodes d'ionisation sont mises en oeuvre dans le cadre des études de biologie structurale : le MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) et l'électronébulisation (ESI, Electrospray Ionization). Ces deux techniques possèdent l'avantage d'être suffisamment douces pour ioniser et amener à l'état gazeux des macromolécules biologiques (protéines et des acides amines). La technique protéomique a été mise au point lors de ce travail de thèse, au sein du Laboratoire de Spectrométrie de Masse de l'Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN, CNRS, Gif-sur-Yvette). Ainsi, plusieurs collaborations ont été engagées, qui font intervenir des compétences pluridisciplinaires. Dans une première partie sera décrite l'étude de complexes purifiés selon le protocole TAP. Cette méthodologie a permis la description de nouvelles sous-unités du snRNP U2, ainsi que l'identification d'un nouveau complexe, RES, impliqué dans le processus d'épissage alternatif. La caractérisation d'un complexe ultime (Dcs1 et Dcs2) de dégradation des ARNm a été réalisée. Dans un deuxième temps, la protéomique différentielle a été mise à profil dans le but de mieux appréhender la pathogenèse de la Mucoviscidose. Un élément fondamental a ainsi été révélé : la sous expression de l'Annexine 1, protéine critique du processus anti-inflammatoire/protecteur, et cruciale pour maintenir l'homéostasie et la réparation des tissus après un épisode inflammatoire. Un autre objectif d'étude a consisté en l'identification d'une nitro-réductase issue d'une souche de Bacillus sp. Cette enzyme s'avère capable de réaliser une double réduction du groupement nitro du 3,5-DNBTF. En fin, le dernier chapitre concerne le traitement par plasma froid à pression atmosphérique d'une protéine modèle : le lysosyme. Cette étude a permis d'identifier une modification chimique spécifique des résidus aminés tryptophane. L'ensemble de ces résultats illustre l'importance, dans des domaines très variés, de la protéomique ciblée.
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Parmi l’ensemble des techniques spectroscopiques, la spectrométrie de masse s’est imposée au fil des années comme une méthode analytique incontournable tant au niveau de discipline comme la chimie, la pharmacologie, la géologie, l’environnement, la biologie/biochimie, la médecine ou les sciences médico-légales... Cet outil a la capacité de séparer, de mesurer, de quantifier et d’obtenir de l’information structurale de particules subatomiques, d’atomes, de groupes d’atomes, de molécules, de macromolécules et maintenant d’agrégats moléculaires. Après un bref historique consacré à identifier les travaux de recherche du siècle dernier qui ont conduit à la naissance de la spectrométrie de masse, ce mémoire présente une vision pédagogique nouvelle de l’enseignement de la spectrométrie de masse auprès d’étudiants (non physiciens) en biologie/biochimie, en médecine, en chimie... La spectrométrie de masse de type matrix-assisted laser/desorption ionization (MALDI)-time-of-flight (TOF) est plus particulièrement développée et est illustrée par la présentation de travaux relatifs à : (i) la caractérisation structurale de modifications post-traductionnelles comme la glycosylation, (ii) l’approche protéomique des cellules endothéliales de capillaires cérébraux au phénotype barrière hémato-encéphalique et (iii) le profilage en masse de milieu biologique ou de bactéries. De par ses atouts, la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF jouera sans nul doute dans les prochaines années un rôle prépondérant pour le management de la qualité et de la sécurité alimentaires. Les méthodes et les concepts restent cependant à inviter et à d’adapter au domaine agro-alimentaire. We are what we eat !
Author: Aurélie Même Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 197
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Compte tenu de l’omniprésence des interactions non-covalentes en chimie et en biologie, leur étude est devenue incontournable. Les techniques analytiques les plus fréquemment utilisées comme la RMN et la cristallographie RX sont difficiles voire impossibles à mettre en œuvre pour l’analyse de certains édifices non-covalents. De nouveaux outils analytiques sont par conséquent nécessaires pour résoudre ces problématiques. Lors de ce travail de thèse, nous avons donc évalué le potentiel de la spectrométrie de masse et notamment de deux techniques d’ionisation douce : l’ionisation électrospray (ESI-MS) et l’Ionisation/Désorption Laser Assistée par Matrice (MALDI-MS). Ce travail s’est articulé selon trois axes : i) l’analyse d’édifices neutres, insolubles ou solubles dans des solvants très volatils comme le dichlorométhane ou le chloroforme : ces analytes offrent l’opportunité de tester une approche par MALDI-MS comme alternative à l’ESI-MS, ii) l’étude in vivo et in vitro d’une petite molécule à visée thérapeutique, le myo-Inositol trispyrophosphate (ITPP), dans le sang : cette étude doit permettre de mieux comprendre le mécanisme de régulation de l’ITPP, iii) l’étude du complexe Adx/AdR, impliqué dans la biosynthèse des stéroïdes chez les vertébrés : la mesure des constantes de stabilité des complexes formés à partir de variants d’Adx doit permettre de mieux comprendre le mécanisme d’interaction entre ces deux partenaires redox lors du transfert d’électron.
Author: Paul Hannewald Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 0
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La découverte de nouveaux médicaments par le criblage biomoléculaire est au centre de la recherche pharmaceutique actuelle. La spectrométrie de masse, en tant que technique d'analyse fiable, reproductible, sensible, spécifique, compatible avec de nombreux types d'échantillons et permettant un débit d'analyse conséquent, trouve ainsi sa place dans les stratégies de recherche et développement de nouveaux médicaments. Le but de ce travail était de mettre en place et de valider une stratégie originale, impliquant la désorption/ionisation laser assistée par matrice couplée à la spectrométrie de masse (MALDI-MS) comme technique de détection, en vue du criblage de la liaison de composés à des cibles moléculaires applicable directement à des extraits de plantes. Le protocole que nous avons développé s'articule en trois étapes successives qui sont l'incubation des molécules à tester avec la cible moléculaire choisie (la tubuline ou la DHFR), l'élimination des composés non liés et enfin l'analyse par MALDI-TOFMS des composés liés. Notre démarche a fait l'objet d'une démarche de validation et les résultats pouvant être obtenus ont été discutés. Le débit pouvant être évalué à 60 échantillons en 1h50 à 3h30 soit de 18 à 32 échantillons à l'heure. Enfin, une démarche innovante nous a permis de prouver que notre approche pouvait être utile également en criblage secondaire. L'application de notre approche à des extraits bruts de plantes (Colchique d'Automne, Pervenche de Madagascar et Thé vert) à permis de mettre en évidence 20 molécules actives se liant à l'une ou l'autre des cibles moléculaires utilisées et d'évaluer l'affinité relative de l'une d'entre elles.
Author: Giorgio Montaudo Publisher: CRC Press ISBN: 1420037757 Category : Science Languages : en Pages : 601
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Mass Spectrometry (MS) has rapidly become an indispensable tool in polymer analysis, and modern MS today complements in many ways the structural data provided by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Infrared (IR) methods. Recent advances have sparked a growing interest in this field and established a need for a summary of progress made and results
Author: MARC.. MONIATTE
Author: MARC.. MONIATTE
Author: DAMARYS.. LOEW
Author: Nükhet Cavusoglu
Author: Nha Thi Nguyen Huynh
Author: Ana Paula Moraes Ventura
Author: 
Author: Christophe Flahaut
Author: Aurélie Même
Author: Paul Hannewald
Author: Giorgio Montaudo