Apport de la spectrométrie de masse à l'étude de modifications post-traductionnelles et à la protéomique PDF Download
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Ces 10 dernières années ont vu une évolution rapide de la spectrométrie de masse en fonction des besoins croissant des biologistes, dès l'avènement des nouvelles techniques d'ionisation dite douces que sont le MALDI (Désorption Ionisation laser assisté par matrice) et l'ESI (ionisation electrospray) permettant enfin la détection intacte de molécules d'origine biologique.Ce travail de thèse a porté principalement sur le choix et la mise au point de la stratégie instrumentale et analytique pour mener à bien quatre collaborations, soient quatre problèmes montrant à la fois la diversité des approches et la multiplicité des solutions apportées par la spectrométrie de masse. Le premier sujet a porté sur l'isolement de peptides biologiquement actifs dans l'hémolymphe de drosophiles immunisées. Nous avons réalisé le séquençage de novo par spectrométrie de masse de l'un de ces peptides bloqué en N-terminal, appelé DIM 13 (Drosophila Immune Induced molecule 13). Le second sujet a porté sur l'étude de la conformité structurale d'une enzyme, la dipeptidyl-diamino-peptidase. Nous avons pu établir la conformité de la protéine recombinante par rapport à la protéine naturelle et donné la description détaillée de ses modifications post-traductionnnelles.Le troisième sujet a consisté à l'établissement du protéome de la rétine de souris. Une première approche a conduit à l'identification d'une centaine de protéines de la rétine. Puis dans une seconde approche une étude différentielle a été entreprise comparant les protéines observées sur gel SDS PAGE 2D obtenu à partir de rétines de souris normales versus les protéines obtenues à partir de rétines de souris rd1 (retinal degenerescence 1). Enfin la dernière étude a porté sur la description de la composition en protéines d'un complexe de facteur de transcription, le complexe TFTC. Notre approche a permis d'ajouter 2 nouvelles protéines à la liste des protéine déjà identifiées par des méthodes de biochimie classique.
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Ces 10 dernières années ont vu une évolution rapide de la spectrométrie de masse en fonction des besoins croissant des biologistes, dès l'avènement des nouvelles techniques d'ionisation dite douces que sont le MALDI (Désorption Ionisation laser assisté par matrice) et l'ESI (ionisation electrospray) permettant enfin la détection intacte de molécules d'origine biologique.Ce travail de thèse a porté principalement sur le choix et la mise au point de la stratégie instrumentale et analytique pour mener à bien quatre collaborations, soient quatre problèmes montrant à la fois la diversité des approches et la multiplicité des solutions apportées par la spectrométrie de masse. Le premier sujet a porté sur l'isolement de peptides biologiquement actifs dans l'hémolymphe de drosophiles immunisées. Nous avons réalisé le séquençage de novo par spectrométrie de masse de l'un de ces peptides bloqué en N-terminal, appelé DIM 13 (Drosophila Immune Induced molecule 13). Le second sujet a porté sur l'étude de la conformité structurale d'une enzyme, la dipeptidyl-diamino-peptidase. Nous avons pu établir la conformité de la protéine recombinante par rapport à la protéine naturelle et donné la description détaillée de ses modifications post-traductionnnelles.Le troisième sujet a consisté à l'établissement du protéome de la rétine de souris. Une première approche a conduit à l'identification d'une centaine de protéines de la rétine. Puis dans une seconde approche une étude différentielle a été entreprise comparant les protéines observées sur gel SDS PAGE 2D obtenu à partir de rétines de souris normales versus les protéines obtenues à partir de rétines de souris rd1 (retinal degenerescence 1). Enfin la dernière étude a porté sur la description de la composition en protéines d'un complexe de facteur de transcription, le complexe TFTC. Notre approche a permis d'ajouter 2 nouvelles protéines à la liste des protéine déjà identifiées par des méthodes de biochimie classique.
Author: Ana Paula Moraes Ventura Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 552
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Grâce au séquençage des génomes et aux progrès de la spectrométrie de masse, l'analyse protéomique se révèle un outil puissant pour l'identification des protéines. Les techniques telles que l'électrophorèse bidimensionnelle, la spectrométrie de masse et la bioinformatique constituent les clés d'une approche nommée " méthodologie classique de la protéomique ". La recherche en protéomique évolue de plus en plus vers la caractérisation de protéines issues de mélanges complexes, avec pour but de mieux comprendre les systèmes biologiques, les interactions entre protéines, ainsi que leurs fonctions. Deux méthodes d'ionisation sont mises en oeuvre dans le cadre des études de biologie structurale : le MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) et l'électronébulisation (ESI, Electrospray Ionization). Ces deux techniques possèdent l'avantage d'être suffisamment douces pour ioniser et amener à l'état gazeux des macromolécules biologiques (protéines et des acides amines). La technique protéomique a été mise au point lors de ce travail de thèse, au sein du Laboratoire de Spectrométrie de Masse de l'Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN, CNRS, Gif-sur-Yvette). Ainsi, plusieurs collaborations ont été engagées, qui font intervenir des compétences pluridisciplinaires. Dans une première partie sera décrite l'étude de complexes purifiés selon le protocole TAP. Cette méthodologie a permis la description de nouvelles sous-unités du snRNP U2, ainsi que l'identification d'un nouveau complexe, RES, impliqué dans le processus d'épissage alternatif. La caractérisation d'un complexe ultime (Dcs1 et Dcs2) de dégradation des ARNm a été réalisée. Dans un deuxième temps, la protéomique différentielle a été mise à profil dans le but de mieux appréhender la pathogenèse de la Mucoviscidose. Un élément fondamental a ainsi été révélé : la sous expression de l'Annexine 1, protéine critique du processus anti-inflammatoire/protecteur, et cruciale pour maintenir l'homéostasie et la réparation des tissus après un épisode inflammatoire. Un autre objectif d'étude a consisté en l'identification d'une nitro-réductase issue d'une souche de Bacillus sp. Cette enzyme s'avère capable de réaliser une double réduction du groupement nitro du 3,5-DNBTF. En fin, le dernier chapitre concerne le traitement par plasma froid à pression atmosphérique d'une protéine modèle : le lysosyme. Cette étude a permis d'identifier une modification chimique spécifique des résidus aminés tryptophane. L'ensemble de ces résultats illustre l'importance, dans des domaines très variés, de la protéomique ciblée.
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE EST AUJOURD'HUI DEVENUE UNE TECHNIQUE INCONTOURNABLE POUR LA RECHERCHE EN BIOCHIMIE. ELLE A CONNU CES DIX DERNIERES ANNEES, UN ESSOR CONSIDERABLE DANS LA CARACTERISATION DES BIOMOLECULES ET EN PARTICULIER DANS L'ANALYSE DES PEPTIDES ET DES PROTEINES. CE TRAVAIL DE THESE A ETE ORIENTE SIMULTANEMENT DANS DEUX DIRECTIONS. NOUS AVONS D'UNE PART PROGRESSE DANS L'UTILISATION DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE POUR OBTENIR DES DONNEES STRUCTURALES, PRINCIPALEMENT EN FOCALISANT SUR L'AMELIORATION DE LA METHODE POUR ATTEINDRE LE DOMAINE SUB-PICOMOLAIRE. NOUS AVONS AMELIORE : - LA SENSIBILITE EN NANOES-MS A L'AIDE D'UN BANC D'ESSAI PERMETTANT L'EVALUATION DU CAPILLAIRE. - LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE EN MALDI-MS GRACE A UNE PREPARATION DE L'ECHANTILLON ADAPTEE. NOUS AVONS D'AUTRE PART, RELEVE LE DEFI QUI CONSISTAIT A RESOUDRE DES PROBLEMES DE CARACTERISATION POSES PAR LES BIOCHIMISTES AUX SPECTROMETRISTES DE MASSE, APRES EPUISEMENT DE TOUTES LES AUTRES POSSIBILITES DES ANALYSES CLASSIQUES (RMN, DEGRADATION D'EDMAN, COMPOSITION EN ACIDES AMINES, GEL D'ELECTROPHORESE). GRACE AU GAIN DE SENSIBILITE ET A L'AMELIORATION DE LA PRECISION DE LA MESURE DE MASSE, NOUS AVONS PU ABORDE L'ETUDE DE PROBLEMES BIOLOGIQUES REELS ET AINSI CARACTERISER : - LA PREMIERE TOXINE DE SCORPION GLYCOSYLEE, - UN PEPTIDE ANTIBACTERIEN DE CREVETTE PANAEUS VANNAMEI, - UNE NOUVELLE MODIFICATION POST-TRADUCTIONNELLE DE LA SCHISTOSOMA MANSONI P28. NOUS AVONS D'AUTRE PART : - IDENTIFIE LA KININOGENE HUMAINE, PROTEINE RESPONSABLE DE L'IMMUNOGENICITE DE LOTS DE FACTEUR VIII. CETTE ETUDE S'INSCRIT DANS LE CADRE GENERAL DU PROJET PROTEOME, - LOCALISE UN PEPTIDE MODIFIE CHIMIQUEMENT PAR PHOTOMARQUAGE LORS DE L'ETUDE DES SITES DE LIAISON DE LA BUCHE, - DETERMINE DES SITES SPECIFIQUES D'HYDROLYSE DE LA GPV ET DE RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (PAR 1, PAR 2).
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Depuis les années 80, l'amélioration des techniques d'ionisation dans le domaine de la spectrométrie de masse a permis son application sur des échantillons biologiques solides, et en a fait une technique de choix pour l'étude des protéines. Dans un premier temps, après un bref rappel sur les caractéristiques histologiques et physiologiques de la dentine, nous nous focaliserons sur la composition protéique? Dans un deuxième temps, nous expliquerons les grands principes de la spectrométrie de masse, et notamment le prinicpe de fonctionnement des appareils de type MALDI-TOF. Enfin, dans la troisème partie de cet ouvrage, nous aborderons le partie expérimentale de notre étude autour de trois objectifs principaux : -Rechercher un protocole de préparation des échantillons pour les rendre compatibles avec l'analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. -Obtenir des profils drotéiques de protèines dentaires. -Obtenir des images par spectrométrie de masse de la distribution de protéines dentaires à la surface d'une coupe longitudinale de dent. Conclusion : seuls les échantillons ayant été déminiéralisés et inclus dans la paraffine ont pu être analysés mais les résultats obtenus sont très prometteurs. La prochaine étape serait d'identifier les protéines mise en évidence lors de nos recherches. Les applications futures sont multiples, tant dans le domaine de la physiologie que de la pathologie dentinaires
Author: François Delalande Publisher: ISBN: Category : Languages : fr Pages : 252
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Le couplage chromatographie liquide-spectrométrie de masse est devenu une méthode de choix pour la quantification de molécules dans une matrice, la détermination des séquences primaires de peptides et de protéines ainsi que la mise en évidence de modifications post-traductionnelles. Les progrès réalisés tant au niveau de la LC qu'au niveau de la spectrométrie de masse ont aussi révolutionné la biologie en permettant une identification sur des quantités femtomolaires de protéines séparées par électrophorèse bidimensionelle dans le cadre d'études protéomiques et la détection toujours plus sensible de molécules d'intérêt par exemple dans les fluides biologiques (plasma, urine, LCR).Mon travail de thèse a porté sur le choix et la mise au point de stratégies instrumentales et analytiques en optimisant de façon poussée tous les paramètres du couplage LC-MS et LC-MS-MS. La première partie concerne la mise au point expérimentale de techniques de microLC-MS et microLC-MS-MS pour la caractérisation de composés peptidiques et la mesure de leur biodisponibilité. La seconde partie porte sur le développement, l'optimisation et l'utilisation de la nano-LC-MS pour l'étude protéomique avec une première étude protéomique visant à caractériser les interactions entre le riz et le rice yellow mottle virus. Ce travail a permis par les techniques MALDI-MS et LC-MS-MS, de mettre en évidence les protéines du riz recrutées par les protéines de capside du virus et l'identification des protéines différentiellement exprimées selon la variété de riz (résistant/sensible). La seconde étude protéomique concerne la caractérisation de marqueurs d'expressions liés à l'anomalie "Mantled" chez le palmier à huile faisant appel au séquençage de novo. Pour conclure, nous avons utilisé les multiples potentiels du couplage microLC-MS et nanoLC-MS-MS pour répondre à différents problèmes biologiques. Ces réponses n'ont pu être obtenues que grâce à la mise au point de méthodologie particulière.
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Parmi l’ensemble des techniques spectroscopiques, la spectrométrie de masse s’est imposée au fil des années comme une méthode analytique incontournable tant au niveau de discipline comme la chimie, la pharmacologie, la géologie, l’environnement, la biologie/biochimie, la médecine ou les sciences médico-légales... Cet outil a la capacité de séparer, de mesurer, de quantifier et d’obtenir de l’information structurale de particules subatomiques, d’atomes, de groupes d’atomes, de molécules, de macromolécules et maintenant d’agrégats moléculaires. Après un bref historique consacré à identifier les travaux de recherche du siècle dernier qui ont conduit à la naissance de la spectrométrie de masse, ce mémoire présente une vision pédagogique nouvelle de l’enseignement de la spectrométrie de masse auprès d’étudiants (non physiciens) en biologie/biochimie, en médecine, en chimie... La spectrométrie de masse de type matrix-assisted laser/desorption ionization (MALDI)-time-of-flight (TOF) est plus particulièrement développée et est illustrée par la présentation de travaux relatifs à : (i) la caractérisation structurale de modifications post-traductionnelles comme la glycosylation, (ii) l’approche protéomique des cellules endothéliales de capillaires cérébraux au phénotype barrière hémato-encéphalique et (iii) le profilage en masse de milieu biologique ou de bactéries. De par ses atouts, la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF jouera sans nul doute dans les prochaines années un rôle prépondérant pour le management de la qualité et de la sécurité alimentaires. Les méthodes et les concepts restent cependant à inviter et à d’adapter au domaine agro-alimentaire. We are what we eat !
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LA SPECTROMETRIE DE MASSE FAB OCCUPE A L'HEURE ACTUELLE UNE PLACE IMPORTANCE DANS L'ETUDE DES PROTEINES; ELLE TROUVE SA PLEINE UTILISATION DANS CERTAINES ANALYSES TRES DIFFICILES A REALISER PAR LES METHODES TRADITIONNELLES COMME LA LOCALISATION ET LA DETERMINATION DE MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES ET DE MUTATIONS EN PATHOLOGIE HUMAINE. DES ANALYSES UTILISANT CONJOINTEMENT DES METHODES DE SPECTROMETRIE DE MASSE: FAB-MAPPING ET SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM ET DES DEGRADATIONS ENZYMATIQUES NOUS ONT PERMIS DE CARACTERISER DE NOUVEAUX MUTANTS DE L'HEMOGLOBINE (MUTANT GRENOBLE ET MUTANT R). LA STRATEGIE UTILISEE A ETE PREALABLEMENT TESTEE SUR DES MUTANTS CONNUS. L'IDENTIFICATION DE DEUX RESIDUS ACETYLE SUR DES ENZYMES ERYTHROCYTAIRES MPGM ET DPGM A ETE REALISE SELON DES STRATEGIES VOISINES. AFIN D'ESSAYER DE RESOUDRE LES PROBLEMES POSES PAR LA DESORPTION DE PEPTIDES EN MELANGE DANS LE MODE D'IONISATION FAB, NOUS AVONS, EN REGARD AVEC DES DONNEES DE LA LITTERATURE, REALISE UNE SERIE DE DERIVATIONS TENDANT A AUGMENTER L'HYDROPHOBIE DES DIFFERENTS CONSTITUANTS ET ACCROITRE AINSI LE RENDEMENT D'IONISATION. CETTE TECHNIQUE DE DERIVATION A PERMIS LA VISUALISATION DE LA TOTALITE DES PEPTIDES ISSUS DE LA CHAINE AINSI QUE L'IDENTIFICATION DE MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES SUR LE PEPTIDE C TERMINAL DE LA TUBULINE QUI N'ETAIT PAS DESORBE A L'ETAT NATIF
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La spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight) et ESI-TOF (electrospray ionization- time of flight) permettent d'accéder à des méthodologies performantes pour l'étude de la structure primaire des protéines. Ce travail a mis en oeuvre ces deux modes d'ionisation pour étudier les modifications covalentes de trois protéines impliquées dans des contextes biologiques différents. En premier lieu, les modifications post-traductionnelles de deux nitrile hydratases (NHases), métalloenzymes bactériennes catalysant l'hydrolyse de nitriles en amides, ont été caractérisées. Des études sur les protéines intactes ont mis en évidence deux modifications post-traductionnelles--un acide sulfénique et un acide sulfinique--sur les cystéines du centre actif de deux NHases de bactéries différentes. Ensuite, nous avons caractérisé les modifications post-traductionnelles d'une protéine intervenant dans la coagulation sanguine, le facteur IX (FIX), dans le but d'établir une référence structurale du FIX plasmatique. Cette protéine comporte un ensemble de modifications complexes incluant en particulier N-glycosylations, O-glycosylations, phosphorylation et sulfatation, localisées sur une région de la protéine, le peptide d'activation. En dernier lieu, nous avons étudié les mécanismes d'inhibition suicide de deux cytochromes P450. Pour cela, nous avons caractérisé, grâce à des techniques de marquage par des isotopes stables, les métabolites produits lors de l'hydroxylation de l'acide tiénilique par le P450 2C9, réaction conduisant également à l'inactivation de l'enzyme. Ces expériences ont conduit à proposer deux mécanismes réactionnels différents pour ce composé. Le mécanisme de l'inhibition suicide d'un P450 d'origine végétale a été abordé en cherchant à identifier les peptides marqués pendant la réaction. Cette identification n'a pas été obtenue, vraisemblablement en raison de l'instabilité du marquage dans nos conditions d'analyse.
Author: Guillaume Gabant Publisher: ISBN: Category : Languages : en Pages : 0
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Les modifications de protéines, qu'elles soient post-traductionnelles (PTMs) ou induites chimiquement, ont une influence considérable sur l'activité des protéines. Des méthodes de spectrométrie de masse (MS) HRMS, MS/MS CID et ETD, et de biochimie ont été développées pour la caractérisation structurale et cinétique de complexes protéine-ligand et de PTMs, dans le but de disséquer leur mécanisme et de concevoir des médicaments covalents contre des protéines liant des protéases, des kinases, ou l'ADN. La MS combinée avec des outils biochimiques a permis de séquencer l'inhibiteur de protéases grégline, et de détecter une PTM originale. De même, la transposase MOS1, modèle de l'intégrase du VIH pour la conception d'inhibiteurs, s'avère être à la fois acétylée et phosphorylée. Pour la lyase Abf2, une stratégie de piégeage, purification, protéolyse et hydrolyse ADN du complexe covalent Abf2-ADN, couplée à l'analyse MS, a été développée. Enfin, l'interaction entre le surpresseur de métastase hPEBP1 et la locostatine a été disséquée sur la protéine entière et par approche bottom-up. La locostatine s'hydrolyse en butyrate après fixation. Afin d'identifier le site ciblé par la locostatine, les conditions de réaction et de protéolyse ont été optimisées. La présence de réactions non spécifiques a conduit au développement 1) d'un modèle mathématique permettant de déterminer la fraction de liaison optimale pour discriminer le site spécifique des sites non-spécifiques, et 2) d'une méthode pour la quantification parallèle et exhaustive du degré de modification de tous les sites modifiés d'une protéine. Ces outils sont applicables aux ligands covalents de protéines et/ou à leurs PTMs.
Author: Nükhet Cavusoglu
Author: Nükhet Cavusoglu
Author: Ana Paula Moraes Ventura
Author: DAMARYS.. LOEW
Author: Vanessa Grausi
Author: François Delalande
Author: Christophe Flahaut
Author: Françoise Pratbernou
Author: Rusconi, Filippo
Author: Maya Belghazi
Author: Guillaume Gabant